p38絲裂原活化蛋白激酶、上皮細胞間質轉化在胃食管反流病及食管腺癌組織中的表達及其臨床意義

鐘江利 王紅 趙凌葦

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是一個多因素造成的以食管下括約肌為主的胃腸動力障礙性疾病，影響了北美國家超過1/5的人口[1]，我國發病率也超過5%[2]，其高發病率及并發癥嚴重影響了人們的生活質量，長期反復發作的胃食管反流病癌變的風險較高，且Barrett食管是食管腺癌的癌前病變，確診后的食管腺癌預后極差。p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路是MAPK家族中重要的炎癥信號通路。p38 MAPK受外界刺激活化后可使腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleuin-6，IL-6）、IL-8等上調從而誘發炎癥反應[3]。在胃食管反流病中，p38 MAPK能夠被胃酸、胰蛋白酶等激活，通過炎癥因子介導食道黏膜組織的病變過程[4-5]。同時越來越多的證據表明在反流性食管炎-Barrett食管-食管腺癌的演變過程中，食管黏膜細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）扮演極其重要的作用。

有學者發現在膽管癌細胞系ICBD上細菌脂多糖（Lipopolysac-charide，LPS）能夠激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR4）信號轉導通路，活化下游的p38 MAPK信號通路表達上調，導致上皮細胞標志物（Epithelial-cadherin，E-cadherin）的表達顯著降低，而間皮細胞的標志物Vimentin蛋白的表達顯著升高，誘導EMT的發生[6]。本研究旨在探討p38 MAPK、Vimentin、E-cadherin在胃食管反流病及食管腺癌發病過程中的作用。

資料與方法

一、對象

收集2017年1月至2019年4月遵義醫科大學附屬醫院病理科42例胃食管反流病患者蠟塊標本（來源于消化內科內鏡活檢患者）為胃食管反流病組、2013年1月至2019年4月9例食管腺癌患者標本（來源于胸外科行食管腺癌切除術患者）為食管腺癌組、9例食管腺癌癌旁組織標本（來源于食管腺癌患者癌旁黏膜組織）為癌旁組，所有標本均具有完整的信息及病史資料，病理類型由我院病理科醫師診斷，標本的使用經過醫院倫理委員會的同意和許可。42例胃食管反流病標本中，其中男性27例、女性15例；年齡：≥60歲14例、＜60歲28例；幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染：有Hp感染16例、無Hp感染26例；GERD類型：反流性食管炎21例、Barrett食管21例。

二、方法

1.主要試劑：兔抗p38 MAPK單克隆抗體、兔抗E-cadherin單克隆抗體、兔抗Vimentin單克隆抗體由CST公司提供，多聚-L-賴氨酸、檸檬酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色液由上?；蚩萍加邢薰咎峁?，通用型山羊血清由北京中杉金橋公司提供。

2.免疫組化法檢測相關蛋白表達：所有組織標本經石蠟切片后、依次進行脫蠟、去除內源性過氧化物酶、抗原修復、一抗孵育、滴加二抗、DAB顯色等步驟，所用抗體濃度分別為p38 MAPK （1∶400），E-cadherin （1∶400），Vimentin（1∶200）。p38 MAPK特異性染色主要表達于胞漿和胞核，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，E-cadherin特異性染色主要表達于細胞膜，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，Vimentin特異性染色主要表達于胞質和間質，呈棕黃色、棕褐色顆粒。判讀結果以每張切片上染色強度和染色陽性細胞數分別計分，在顯微鏡下排除非特異性染色區域后，找到5個陽性細胞著色最強的視野，分別計數細胞的染色強度和陽性細胞百分率，按兩數據之積計分[7]（兩者相乘0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性）。染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分率：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～30%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。

三、統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均值±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料用例數（百分率）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、p38 MAPK、E-cadherin、V-imentin的表達

p38 MAPK主要表達在胞漿和胞核，呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒，在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽性率分別為11.1%（1/9）、59.5%（25/42）、88.9%（8/9），（見圖1、表1）。

圖1 -p38 MAPK在3組中的表達（×400）

表1 p38 MAPK、E-cadherin、Vimentin在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織、食管腺癌組織中的陽性率（%）

E-cadherin特異性染色主要表達于細胞膜，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽性率分別為88.9%（8/9）、76.2%（32/42）、22.2%（2/9），（見圖2、表1）。

圖2 -E-cadherin在3組中的表達（×400）

Vimentin特異性染色主要表達于胞質和間質，呈棕黃色、棕褐色顆粒，V-imentin在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽性率分別為11.1%（1/9）、69.0%（29/42）、88.9%（8/9），（見圖3、表1）。

圖3 -E-Vimentin在3組中的表達（×400）

二、p38 MAPK、E-cadherin、Vimentin在胃食管反流病的表達與臨床特征之間的關系

p38 MAPK、Vimentin在胃食管反流病中的表達情況與性別、年齡及Hp感染均無關（P＞0.05），與GERD類型有關（P＜0.05）。E-cadherin在胃食管反流病中的表達情況與性別、年齡、Hp感染及GERD類型均無關（P＞0.05），（見表2）。

討 論

p38 MAPK通路已被認定為炎癥反應中細胞因子協同釋放的重要調節因子[8]，激活之后活化下游MAPK激活蛋白激酶2（MK2），MK2通過轉錄調節和產生促炎細胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1來產生炎癥分子，抑制p38激酶可以導致這些促炎介質的顯著減少和炎癥過程的產生[9]。GERD是一種多因素疾病，酸暴露環境通過調節p38 MAPK的活化影響其發生、發展。胃酸和胰蛋白酶等反流物的刺激引起食道黏膜組織中炎癥細胞聚集，繼而引起IL-8、TNF-α等炎癥因子的釋放，這些炎癥因子通過下調緊密連接蛋白的表達來誘導上皮屏障功能的損傷，這會導致黏膜上皮的炎癥反應加重，形成惡性循環[10]。柳剛[11]通過原代培養人食管上皮，給予酸、胰蛋白酶刺激及胃底結扎加幽口限制法誘導形成反流性食管炎模型并運用免疫組化、PCR、Western blotting分析等方法驗證了這一觀點，在胃食管反流病中p38 MAPK通路在胰蛋白酶和酸的刺激下激活誘發炎癥，從而造成食管黏膜上皮的炎性損傷。另有研究報道，抑制p38 MAPK激活，通過調節食管屏障功能和調節炎癥細胞的聚集，以及NO和活性氧的形成可以減輕酸性反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）大鼠食管黏膜損傷[12]。與沒有Barrett食管（Barrett esophagus，BE）的人相比，BE的存在增加了食管腺癌30至120倍的風險，但最近的幾項研究表明，即使在沒有BE的存在下，長期存在GERD本身就是一種腺癌的風險因子，這種風險與GERD頻率、嚴重程度以及反流癥狀的持續時間相關[13]。BE是一種癌前病變，長期存在GERD癥狀，主要由酸和膽鹽的反流所致，膽汁酸和鹽酸可誘導活性氧和一氧化氮的產生，與DNA損傷和基因突變有關[14-15]。這些機制涉及MAPK途徑從細胞表面到細胞核的信號[16]。在有和沒有Barrett食管的GERD患者的活檢中，發現了酸暴露激活的MAPK通路的差異，這些差異可能是Barrett食管化生發展的基礎[17]。本試驗中，p38 MAPK蛋白在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病、食管腺癌中陽性表達率逐漸升高，且與GERD患者性別、年齡、是否存在Hp感染均無關，而是隨著胃食管反流病的發病過程呈現遞增趨勢，在RE、BE中差異明顯，說明p38 MAPK通路在胃食管反流病的不同類型中表達不同，并可能參與了胃食管反流病及食管腺癌的發病，但由于標本量較少，胃食管反流病組與腺癌組差異不太明顯。

目前有關EMT的研究認為上皮細胞的不同程度轉化受細胞內信號轉導機制的精確調控。細胞外信號轉導通過與細胞表面特異性受體相結合將信號轉入細胞內，再通過胞內的轉化生長因子-β、Wnt、Notch、Hedgehog、磷脂酰肌醇3激酶、NF-κB、MAPK等信號轉導途徑，活化核內轉導因子，調節轉導基因表達，在發育、傷口愈合、纖維化和癌癥進展中都有著十分重要的作用。有研究表明，EMT在食管炎到食管癌的的纖維化過程中有著十分重要的作用。ROS可以活化NF-κB等轉錄因子，進而促進蛋白磷酸化及TGF-β表達增加，從而導致食管的纖維化過程[18]。炎癥在GERD損傷中的作用已得到國內外學者的廣泛認可，從GERD患者的食管可活檢出IL-6、IL-8和IL-1β等炎性介質[19]。酸和TLR4配體LPS刺激食管上皮下肌成纖維細胞，可激活NF-κB和辣椒素受體1，并促進IL-6、IL-8等炎癥因子分泌，造成食管黏膜炎癥性損害以及食管高敏狀態，表明上皮-間質的相互作用可能和胃食管反流病發生、發展存在著相關性[20]。在膽汁反流動物模型中觀察到炎癥細胞、IL-6和腫瘤壞死因子-α的過表達，膽汁可能通過誘導食管炎癥反應而促BE的發展[21]。另外，Zhang等[22]用酸性膽汁鹽處理Barrett食管細胞時，發現血管內皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）分泌迅速增加，VEGF-A的增加伴隨著VEGFR2磷酸化的增加，下游信號通路的激活導致E盒結合鋅指蛋白的上調，E-cadherin的下調和細胞遷移的增加。抑制VEGF/VEGFR2信號（通過VEGF阻斷抗體，VEGF-A基因缺失，藥理性VEGFR2抑制或VEGFR2 shRNA）消除了這些EMT功能。這項研究表明，酸性膽汁鹽可以通過激活VEGF/VEGFR2信號傳導來誘導食管Barrett細胞的EMT功能，即EMT導致Barrett食道患者發生腸化生。腸型化生黏膜取代胃食管反流酸和膽汁損傷的食管鱗狀黏膜，是食管腺癌的主要危險因素。本試驗中，從食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病至食管腺癌中，E-cadherin呈遞減趨勢表達，Vimentin呈遞增趨勢表達，提示E-cadherin、Vimentin可能參與了胃食管反流病及食管腺癌的發病過程。但可能由于標本量較少，導致E-cadherin的表達在胃食管反流病組與癌旁組相比差異不明顯，Vimentin的表達在胃食管反流病組與腺癌組相比差異不明顯。E-cadherin的表達與性別、年齡、是否存在Hp感染及GERD臨床類型均無關。Vimentin的表達與性別、年齡、是否存在Hp感染均無關，在BE、RE中，表達有顯著差異。這也許是因為在炎癥向腫瘤發展的早期階段可能會發生間質向上皮的轉變，導致早期疾病中波形蛋白陽性表達的趨勢較高[23]。

在胃食管反流病中，p38 MAPK能夠被胃酸、胰蛋白酶等激活誘導食道黏膜上皮細胞的炎癥因子分泌，p38 MAPK失活可以抑制這一反應，并抑制食道黏膜上皮中這些緊密連接功能蛋白的表達下調，緊密連接蛋白的降低通常認為是細胞EMT化的重要前期指針。本實驗僅說明在胃食管反流病、食管腺癌的發病過程中，p38 MAPK、EMT都有著十分重要的作用，可能是在酸和膽鹽的刺激下p38 MAPK活化后調控下游TNF-α、IL-6等炎癥因子，通過其各自的途徑促進了EMT[24，25]?？赡苁莗38 MAPK激活了活性氧簇，從而誘發了食管纖維化的EMT導致了胃食管反流病發展的過程，也可能是更多通路的共同作用，這就需要在本試驗的基礎上加大樣本量研究，并結合動物學、細胞學試驗來進一步闡明其中的機制。