利用外源蛋白酶和曲霉菌YL001加速沙丁魚魚露的發酵

趙帥東，劉婷，季旭，楊梓璐，尹軒威，施文正，汪立平,2,3*，寧喜斌*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306) 3(上海海洋大學，食品熱加工工程技術研究中心，上海，201306)

魚露是一種傳統的調味品，通常以低值魚蝦或水產品加工下腳料為原料經過自然發酵釀造而成，其滋味鮮美，風味獨特，深受國內外消費者的喜愛[1]。自然發酵魚露的生產周期較長，一般為數月乃至1年以上，為了獲得更好的風味，有的甚至長達2～3年[2]。因此，縮短魚露的發酵周期，提高企業的生產效率一直是國內外研究的重點。目前，縮短魚露發酵周期的主要方法為保溫法、外加酶法及外加曲法。LOPETCHARAT等[3]發現，當太平洋鱈魚的發酵溫度提高到50 ℃時，發酵液中的總氮含量在發酵15 d后與商品魚露的含量一致。RABIE等[4]使用了不同濃度的菠蘿蛋白酶加速鯖魚魚露的發酵，發現添加較高濃度菠蘿蛋白酶的樣品在發酵90 d后具有更高含量的氨基酸態氮(6.2 g/L)。TAKANO等[5]在下腳料中加入曲，室溫發酵6個月后，魚露的總氮含量達到了15 g/L。然而，提高發酵溫度會增加魚露的生產成本，添加富含酶的內臟或商業蛋白酶會影響魚露的風味，較高的鹽濃度會限制曲霉菌的生長。復合蛋白酶是內切酶，主要將蛋白質顆粒水解成小分子肽，水解能力高，但風味較差；而風味蛋白酶為外切酶，它的加入不僅能進一步提高水解程度，而且能夠改善風味。因此，本文選用復合蛋白酶和風味蛋白酶作為外源蛋白酶。另外，曲霉菌YL001是1株從醬油曲中分離的產蛋白酶的菌株，其分泌的蛋白酶能加快沙丁魚魚露的發酵過程。因此，本文以沙丁魚魚肉為原料，以僅添加外源蛋白酶為對照，通過添加外源蛋白酶和曲霉菌YL001加速沙丁魚魚露的發酵。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙丁魚，由寧波佳必可食品有限公司提供，使用前置于冰箱-20 ℃冷凍備用。復合蛋白酶(1.5 AU/g)、風味蛋白酶(500 LAPU/g)，諾維信(中國)生物技術有限公司；曲霉菌YL001，本研究室保藏；氨基酸標準品，美國Sigma公司；其他化學試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

JYSA800型絞肉機，九陽股份有限公司；PHS-3C型 pH 酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯分析儀器公司；H2050R型高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；7200可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱、數顯式恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；恒溫磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；SPME手柄與萃取頭，美國Supelco公司；7890 N/5975C氣質聯用儀，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 曲霉菌YL001成曲的制備

將曲霉菌YL001接種于PDA培養基中，置于30 ℃恒溫培養箱培養48 h，用來制備成曲。成曲的制備參照白政澤等[6]的方法。

1.2.2 沙丁魚魚露的制備

將冷凍的沙丁魚在流水中(25 ℃)中解凍1 h，解凍后去除頭、尾、內臟和骨頭。然后，用絞肉機將其斬拌成魚糜。接著，將500 g沙丁魚魚糜與500 mL蒸餾水混合。先加入質量分數為0.5%的復合蛋白酶，50 ℃水浴2.5 h，再加入質量分數為0.7%的風味蛋白酶，55 ℃繼續水浴2.5 h。然后將酶解液分為2組：第一組加入質量分數為15%的鹽，為魚露A；第二組加入質量分數為15%的鹽和質量分數為14%的曲霉菌YL001，為魚露B。將混合物置于1 000 mL的燒杯中，用8層紗布覆蓋，以保持半需氧狀態。為獲得具有良好風味的魚露，首先將樣品在35 ℃的恒溫培養箱中發酵30 d，然后在室溫(15～25 ℃)下繼續發酵150 d。由此得到的發酵醪液，先添加60 g/L海藻糖,在40 ℃中水浴120 min除腥，然后以8 000 r/min離心20 min，最后在90 ℃水浴中加熱20 min進行滅菌，得到魚露A和魚露B。

1.2.3 pH的測定

用pH計直接測量魚露樣品的pH值。

1.2.4 總酸及氨基酸態氮的測定

總酸及氨基酸態氮的測定參照GB 5009.235—2016中甲醛滴定法。

1.2.5 總可溶性氮的測定

總可溶性氮的測定參照GB/T 5009.5—2016中凱氏定氮法。

1.2.6 揮發性鹽基氮及NaCl的測定

揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)的測定參照GB 5009.228—2016中自動凱式定氮儀法。

NaCl的測定參照GB 5009.44—2016中銀量法。

1.2.7 非酶褐變的測定

非酶褐變的測定參照ZHONG等[7]的方法。將5 mL 魚露樣品與50 mL體積分數為50%的乙醇混合，然后用磁力攪拌器攪拌1 h。在5 000 r/min下離心15 min，上清液在420 nm處測量吸光度。

1.2.8 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定，參照CHEN等[8]的方法。將2 mL魚露樣品加到15 mL 50 g/L的三氯乙酸中，用旋渦混合器振蕩2 min。然后將樣品超聲處理5 min，離心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)后棄去沉淀。取5 mL上清液于燒杯中，用6、1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至2.0后，定容到10 mL。取定容后的溶液1 mL，用超純水稀釋至50 mL。最后將稀釋液用0.22 μm水相濾膜過濾后，放入進樣瓶中測定。

1.2.9 揮發性化合物的鑒定

參照GAO等[9]的方法，采用SPME-GC-MS法對魚露的揮發性成分進行了測定。將5 mL魚露樣品加入頂空瓶(20 mL)。將萃取頭插入到頂空瓶中，并在60 ℃下吸附30 min后，迅速插入氣相色譜進樣口，在250 ℃下解吸3 min。GC使用HP-5MS柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)作為分離柱。柱初溫40 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min的速度升溫至90 ℃，再以8 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持7 min。載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。離子化方式為電子轟擊，質譜離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV；不分流進樣；檢測模式采用全譜掃描，質量掃描范圍為35～550m/z。

1.2.10 感官評價

感官評價參照XU等[10]的方法。選擇9名研究生(5名男性和4名女性，年齡25～30歲)進行感官評價。經過訓練的組員對不同風味的魚露(焦糖味、肉味、鮮味、酸味、苦味、魚腥味、氨味、腐臭味)進行評價打分。計分采用10分制，“1”分代表該風味不能被感覺到，“10”分代表該風味非常強烈。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵對魚露pH和總酸含量的影響

魚露A和魚露B發酵過程中pH和總酸的變化分別如圖1和圖2所示。在整個發酵過程中，pH值的變化趨勢與總酸的變化趨勢一致。另外，2個魚露樣品的pH值在發酵的前20 d呈增加趨勢，這可能是由于在發酵過程中產生了一些揮發性堿類化合物，如TVB-N、氨和其他降解產物[11-12]。而在發酵末期，水解產物的產生又使得魚露樣品的pH值降低。與魚露A相比，魚露B在發酵過程中的pH值較低，總酸含量較高。這主要是因為魚露B中添加的曲霉菌YL001使其蛋白酶活性高于魚露A，導致沙丁魚中的蛋白質進一步水解，從而使兩者的酸類物質和氨的產生量不同[13]。游離氫離子、游離氨基酸和寡肽氨基酸等水解產物的含量增加，導致魚露B的pH值較低，酸度較高。此外，一些有機酸也會使魚露B的pH值變低，總酸的含量變高[14]。

圖2 發酵過程中總酸的變化Fig.2 Changes in total acids during fermentation process

2.2 蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵對魚露總氮和氨基酸態氮含量的影響

總可溶性氮(total soluble nitrogen，TSN)含量是魚露品質分級的重要指標。日本和韓國規定魚露中的TSN含量應 >10 g/L，而泰國規定二級魚露的TSN含量應 >15 g/L，且一級魚露的TSN含量應 >20 g/L[15]。另外，根據我國魚露的行業標準(SB/T 10324—1999)，一級、二級、三級魚露的最小TSN含量分別為12、8.7和5.4 g/L。發酵過程中2種魚露中的TSN含量變化如圖3所示。隨著發酵的進行，2個魚露樣品的TSN含量均先增加后趨于穩定。經過180 d的發酵后，魚露A和魚露B的TSN含量分別為14.2和16.3 g/L。與魚露A相比，魚露B的TSN含量提高了14.8%。這說明曲霉菌YL001的存在使魚露B具有更高的蛋白酶活性，通過進一步分解魚肉中的蛋白質，從而提高魚露中的TSN含量。

氨基酸態氮(amino acid nitrogen，AAN)是魚露品質分級的另一個重要指標。在日本，氨基酸態氮的含量需要達到總氮的40%以上。我國一級魚露和二級魚露AAN的最低標準分別為9.0和6.5 g/L。如表1所示，發酵180 d后，魚露A中氨基酸態氮的含量為7.6 g/L，符合二級魚露的標準，而魚露B中氨基酸態氮的含量為10.6 g/L，達到了一級魚露的標準。

綜上，與僅加酶發酵相比，先加酶、后加曲霉菌YL001曲的復合發酵法能夠提高沙丁魚魚露中TSN和AAN的含量。

圖3 發酵過程中可溶性總氮的變化Fig.3 Changes in total soluble nitrogen during fermentation process

表1 發酵30和180 d時魚露樣品中氨基酸態氮的含量Table 1 Amino acid nitrogen content of fish sauce samples in 30 and 180 d

2.3 蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵對魚露TVB-N含量和NaCl含量的影響

TVB-N含量是衡量海產品新鮮度和變質程度的重要指標。TVB-N的積累通常與特定腐敗菌、內源酶[16]及能水解蛋白的細菌[17]有關。發酵過程中，魚露A和魚露B中的TVB-N含量變化如圖4所示。在發酵過程中，魚露A和魚露B的TVB-N含量變化趨勢相似，均呈上升趨勢，這與之前的研究一致[10,13,18]。發酵結束時，魚露A和魚露B的TVB-N含量分別為0.68和1.36 g/L。魚露B中TVB-N的含量高于魚露A，這可能是因為曲霉菌YL001在分解沙丁魚肉中的蛋白質時產生了一些揮發性堿類化合物。

如圖5所示，2個魚露樣品在發酵過程中NaCl質量濃度均沒有明顯變化。發酵結束時，魚露A和魚露B的NaCl濃度分別為198.0 和206.9 g/L。據報道，來自東南亞的商業魚露中的NaCl質量濃度為(259±3.7) g/L[19]。顯然，魚露A和B比商業魚露中的NaCl含量要低。魚露發酵過程中低鹽的環境不僅能加速蛋白質的分解，縮短發酵周期，而且能提高魚露的營養價值。隨著低鹽膳食越來越受到人們的推崇，該鹽分含量的魚露相對于傳統高鹽的魚露更具競爭力。

圖4 發酵過程中揮發性鹽基氮的變化Fig.4 Changes in total volatile basic nitrogen during fermentation process

圖5 發酵過程中NaCl含量的變化Fig.5 Changes in NaCl content during fermentation process

2.4 蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵對魚露非酶褐變的影響

魚露的褐色是非酶褐變反應的結果。魚露中的大部分含氮化合物是游離氨基酸和小肽，它們通過美拉德反應形成魚露的褐色[15]。如圖6所示，在魚露A和魚露B中，非酶褐變指數OD420在整個發酵過程中都呈現出增加的趨勢，這與之前的研究相似[13]。顯然，魚露B的非酶褐變指數比魚露A大。這是因為添加曲霉菌YL001后使得魚露B在發酵過程中的蛋白酶和糖化酶活性較高，而其降解產物有助于美拉德反應。

圖6 發酵過程中非酶褐變指數的變化Fig.6 Changes in nonenzymatic browning during fermentation process

2.5 游離氨基酸分析

發酵180 d后，魚露A和魚露B中游離氨基酸的組成和濃度如表2所示。游離氨基酸是魚露中重要的營養成分，在魚露風味的形成中起著關鍵作用[17]。魚露B中除蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸和組氨酸外，其他氨基酸的含量均高于魚露A。而且，魚露B中的鮮味氨基酸，特別是谷氨酸和天冬氨酸的含量顯著高于魚露A。而天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸是形成魚露的特殊發酵風味的重要因素[20]。發酵180 d后，魚露A和魚露B的總游離氨基酸含量分別為84.85和109.46 g/L。魚露B與李銳等[21]報道的傳統發酵魚露中總游離氨基酸總量相似。這些結果表明，先加外源蛋白酶、后加曲霉菌YL001的復合發酵可以促進魚蛋白的分解，提高魚露中游離氨基酸的含量。

表2 沙丁魚魚露中游離氨基酸的含量 單位：g/L

2.6 揮發性化合物的鑒定

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法測定了2種魚露樣品的揮發性成分。如表3所示，共檢測出51種不同的揮發性化合物，包括醛、酮、醇、酯、酸、烷烴等。

表3 魚露A和魚露B中的揮發性化合物 單位：%(相對含量)

醛類化合物是魚露A和B的主要揮發性成分，分別占30.54%和41.06%。由于醛類的閾值較低，因此對魚露的風味有很大貢獻[22]。揮發性醛類通常來源于氨基酸的Strecker降解，它有助于產生理想的香氣，但是也會產生酸敗的氣味和風味[13]。3-甲基丁醛和2-甲基丁醛只在魚露B中檢測到，這2種物質被認為是魚露的特征性風味物質[23]。另外，魚露A和B中都檢測到大量苯乙醛，這與之前的報告相似[24]，不過苯乙醛對魚露的風味影響不大。這些結果表明，曲霉菌YL001可以促進魚露風味的形成。

酮類化合物通常與微生物活性和脂質氧化有關[25]。5-甲基-4-庚烯-3-酮和2，3-二甲基-2-環戊烯-1-酮僅在魚露A中檢出，且在2種魚露中均檢出3，5-辛二烯-2-酮，魚露A的相對含量為15.39%，魚露B的相對含量為10.49%。酮，尤其是烯酮，能增強魚腥味。顯然，曲霉菌YL001的添加可以降低魚露的腥味，從而改善魚露的風味。

魚露A中檢測到的醇類物質含量高于魚露B，但由于其閾值較高，對魚露香氣的貢獻不大[26]。十四酸是魚露A中唯一檢出的酸，占2.99%。酸類主要導致魚露中的酸味[27]，不過一些短鏈脂肪酸有助于形成濃郁的奶酪味[18]。

酯類在魚露B中占8.42%，在魚露A中占5.71%。酯類可能是醇類與微生物或酶分解脂質而形成的羧酸酯化的產物[5]。酯類存在于大多數的發酵產品中，有助于形成水果香及花香。此外，酯類還可以減少和掩蓋游離氨基酸衍生的令人不適的氣味[28]。

烷烴只在魚露A中發現，由于其具有較高的風味閾值，通常認為不會對魚露的風味產生重要影響[25]，但支鏈烷烴可能會導致魚露中產生溶劑狀氣味[24]。2-乙基呋喃僅在魚露B中檢測到，呋喃類化合物具有較低的風味閾值，有助于形成草或豆的風味。

總之，揮發性物質組成和含量的差異表明，添加外源酶、然后加曲霉菌YL001的復合發酵魚露的風味優于單一外源酶發酵。

2.7 感官評價

2種魚露樣品的感官評價如圖7所示，魚露A和魚露B的苦味、酸味、氨味、酸味評分均較低，說明2種魚露發酵180 d后沒有特別濃烈或難聞的味道。此外，魚露B的鮮味和焦糖味的評分較高，這可能與其氨基酸、可溶性總氮和游離氨基酸含量較高，尤其是谷氨酸含量較高有關。因此，利用外源蛋白酶和曲霉菌YL001混合發酵可以提高魚露的風味。

圖7 兩種魚露樣品的感官評價Fig.7 Sensory profiles of two fish sauce samples

3 結論

為了縮短魚露的發酵周期，本研究利用外源蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵的方法制作沙丁魚魚露。沙丁魚首先在35 ℃下發酵30 d，然后在室溫下發酵150 d，這節約了魚露的生產成本。發酵180 d后，魚露A的氨基酸態氮含量和總氮含量分別為7.6和14.2 g/L，品質僅為二級魚露。而魚露B的氨基酸態氮含量和總氮含量分別為10.6和16.3 g/L，魚露品質達到了一級魚露標準(SB/T 10324—1999)。另外，與魚露A相比，魚露B的總酸、非酶褐變指數及游離氨基酸含量均較高。而且，GC-MS分析及感官評價結果表明，復合發酵魚露的產品無異味，且有魚露特有的香味。所以，外源蛋白酶和曲霉菌YL001復合發酵不僅可以縮短沙丁魚魚露的發酵時間，還可以改善其風味。