葛葉多酚的提取工藝及其抗氧化性質

唐婷范　朱家慶　李榮彬　馮軍　黃芳麗　梁杰婷　田玉紅　李曉慧　程昊

摘? 要：采用回流法提取葛葉中的多酚，用福林酚法測定葛葉多酚含量，通過精密度、穩定性和加標回收率試驗驗證適用性，對葛葉多酚的抗氧化性質進行研究，并利用單因素實驗研究對葛葉多酚得率的影響.結果顯示葛葉多酚最佳提取工藝為：溶劑pH值為4、料液比1∶30、70 ℃水浴2.0 h，提取2次，精密度實驗相對標準誤差為0.27%，穩定性實驗相對標準誤差為0.94%，加標回收率實驗相對標準誤差為1.66%，此條件下葛葉多酚得率為2.22%;葛葉多酚對DPPH·和·OH具有較強的清除作用，最大清除率分別為80.99%和76.24%.回流法提取葛葉多酚工藝合理，操作簡單，且提取后的葛葉多酚有較強的抗氧化性，為葛葉多酚的開發利用提供基礎性研究.

關鍵詞：葛葉;多酚;提取工藝;抗氧化性

中圖分類號：TQ91? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.017

0引言

葛葉來源于植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi.的葉，據醫學專著《神農本草經》記載，葛根的莖、葉、花、果、根均可入藥[1]，《別錄》記載其“主金瘡止血”[2].葛葉中含有多酚類化合物.王淑惠等[3]通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）聯用，對不同生長月份的葛葉揮發油進行鑒定，得到20多個成分，其中就包含多酚類物質.多酚是植物體內的復雜酚類次生代謝產物，具有多元酚羥基結構[4].植物多酚由于其有效的抗氧化特性以及在預防各種氧化應激相關疾?。ɡ绨┌Y）中的顯著效果而引起越來越多的關注[5-9].不同植物多酚類提取物的利用和開發已成為食品和醫學相關研究的主要領域[10-12]，多酚的提取工藝是其中一個重要的環節.

目前多酚的提取方法有很多[13-14]，常用的有微波輔助提取法[15]、超臨界流體萃取法、超聲波提取法[16]等.其中微波輔助提取法不適合高溫敏感物質，溫度過高會破壞提取物分子結構;超臨界流體萃取法對設備要求高，成本大;超聲波提取法機械能耗大，溶劑消耗過快.與此相比的回流提取法[17]，操作工藝簡單，不會造成太多的資源浪費，且成本低，是一種常用的植物多酚提取方法.宋力等[18]采用回流法提取菠蘿皮中的多酚，并與微波法、超聲波法等4種方法作對比，發現回流法提取的多酚抗氧化清除率最高.

近年來，對葛根多酚的研究大多數集中在根部，對葛葉多酚研究較少.本實驗以葛葉作為原料，利用回流提取法提取葛葉中多酚，采用福林酚法[19]測定葛葉中多酚的含量，通過精密度、穩定性和加標回收率實驗驗證適用性，并對葛葉多酚得率和多酚提取液的抗氧化性能進行研究.

1材料與方法

1.1?? 材料與試劑

葛葉，選用廣西北海野葛的葉（2019年8月采收）;沒食子酸，分析純，天津市光復精細化工研究所;福林酚試劑、水楊酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠;碳酸鈉，分析純，廣東光華化學廠有限公司;二苯基苦基肼自由基，分析純，WaKo公司;無水乙醇，分析純，臺山市粵僑試劑塑料有限公司.

1.2?? 儀器與設備

V2000型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司;AR124CN分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司;TDL-80-2B低速離心機：上海安亭科學儀器廠;SHZ-95B型循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司;ZY-LDG12真空冷凍干燥機：上海紫裕生物科技有限公司.

1.3?? 實驗方法

1.3.1?? 葛葉原料預處理

選擇品質良好無蟲害的優質葛葉，將其洗凈放入60 ℃烘箱烘干，烘干后的葛葉研磨打碎，備用.

1.3.2?? 葛葉多酚含量的測定

采用福林酚法[19]測定葛葉里的多酚含量，利用福林酚的強氧化性與多酚發生藍色反應，并利用分光光度計在745 nm處進行吸光度檢測.用沒食子酸作為標定物質，利用標準品的標準曲線計算多酚含量.

1.3.3沒食子酸標準曲線的繪制

用分析天平稱量11.00 mg（±0.10 mg）沒食子酸標準品，定容到100 mL容量瓶中配制成質量濃度0.11 mg/mL的沒食子酸標準液;取0.2 mL、 ?0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL沒食子酸標準液，分別加入1.5 mL福林酚試劑和2.0 mL 10% Na2CO3溶液定容于25 mL容量瓶，混合均勻避光反應30 min后在745 nm處測其吸光度[15]，繪制標準曲線.

1.3.4精密度、穩定性和加標回收率實驗

1）精密度實驗

用移液管吸取葛葉多酚提取液2.0 mL至 25 mL容量瓶中，加入1.5 mL福林酚試劑和 ?2.0 mL 10% Na2CO3溶液后用蒸餾水定容，混合均勻避光反應30 min，在745 nm處不間斷測量6次吸光度[20].

2）穩定性實驗

吸取多酚提取液2.0 mL至25 mL容量瓶中，加入福林酚試劑1.5 mL和10% Na2CO3溶液2.0 mL 后用蒸餾水定容，混合均勻避光反應30 min，每隔?? 2 min在745 nm處測量6次吸光度.

3）加標回收率實驗

分別吸取2.0 mL葛葉多酚提取液至5個25 mL容量瓶中，在每個容量瓶中分別加入不同濃度的沒食子酸標準溶液，并計算平均回收率和RSD值.

1.3.5?? 葛葉多酚提取單因素實驗考察

1）溶劑pH對多酚得率的影響

調配pH值為3、4、5、6、7的蒸餾水溶劑，用電子天平稱量2.00 g預處理過的葛葉，加入料液比為1∶30的不同pH值的溶劑，在50 ℃下加熱回流2 h，提取一次[21]，按“1.3.3”步驟測定吸光度，分析數據繪制葛葉多酚得率與pH值曲線圖.

2）提取時間對多酚得率的影響

稱量2.00 g處理過的葛葉，加入料液比為1∶30的pH值為4的溶劑，在50 ℃下加熱回流? 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測定吸光度，分析數據繪制葛葉多酚得率與提取時間曲線圖.

3）料液比對多酚得率的影響

稱量2.00 g處理過的葛葉，加入不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），pH值為4的溶劑，在50 ℃下加熱回流2 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測定吸光度，分析數據繪制葛葉多酚得率與料液比曲線圖.

4）提取溫度對多酚得率的影響

稱量2.00 g處理好的葛葉，加入料液比為 ??1∶30的pH值為4的溶劑，在不同溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）下加熱回流2 h，提取一次，按“1.3.3”步驟測定吸光度，分析數據繪制葛葉多酚得率與提取溫度曲線圖.

5）提取次數對多酚得率的影響

稱量2.00 g處理好的葛葉，加入料液比為1∶30的pH值為4的溶劑，在70 ℃下加熱回流 2 h，提取不同次數（1、2、3、4），按“1.3.3”步驟測定吸光度，分析數據繪制葛葉多酚得率與提取次數曲線圖.

1.3.6葛葉多酚的抗氧化性質研究[22-24]

1）葛葉多酚對DPPH·的清除率

取不同濃度配置好的葛葉樣液2.0 mL，加入0.3 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液2.0 mL，混合搖勻后避光放置30 min，在517 nm處測定吸光度[A1];用2.0 mL無水乙醇代替DPPH·無水乙醇溶液測定吸光度[A2];再以2.0 mL蒸餾水代替葛葉樣液測定吸光度[A0]，用無水乙醇做為空白參比.將樣液替換為標準液按上述步驟做出標準物曲線與樣液清除率作比較.平行測定3次求平均值.DPPH·自由基清除率公式如下：

[DPPH·自由基清除率=1-A1-A2A0×100%]（1）

2）葛葉多酚對·OH的清除率

取試管加入l mL 9.0×10-3 mol/L FeSO4溶液，再加入2.0 mL相同濃度的水楊酸溶液，最后加入 2.0 mL 8.8×10-3 mol/L雙氧水溶液，混合均勻后暗處靜置30 min，在525 nm處測定吸光度[A0]，不加雙氧水溶液作為空白對照.另取試管依次加入 l.0 mL FeSO4溶液、2.0 mL水楊酸溶液、2.0 mL葛葉樣液和2.0 mL雙氧水溶液，在上述條件下測吸光度[A1].按上述在加葛葉樣液不加雙氧水溶液條件下測吸光度[A2]. [A1] 和[A2]以蒸餾水作參比，平行測定3次求平均值.·OH自由基清除率公式如下：

[·OH自由基清除率=A0-A1-A2A0×100%]? （2）

1.3.7數據處理

各實驗指標測定3 次取平均值以減小實驗誤差.使用Origin 8軟件進行數據分析處理和繪制圖表.

2結果與分析

2.1?? 沒食子酸標準曲線

由圖1可知，將標準液質量濃度與所測吸光度值擬合，得到回歸方程[y=0.089x-0.001]，[R2=0.999 8]，說明該曲線具有良好的回歸性.

根據標準物的標準曲線方程可得到多酚的得率計算公式：

[多酚得率=A+0.0010.089×Vm×100%] ??（3）

式中：[A]為提取液吸光度;[V]為提取液體積，mL;[m]為樣品質量，g.

2.2精密度、穩定性和加標回收率結果分析

精密度、穩定性和加標回收率實驗結果見表1—表3.由表1—表3得知，葛葉多酚提取液的精密度、穩定性和加標回收率RSD分別為0.27%、0.94%、1.66%，此方法的平均回收率為95.50%.通過實驗數據結果說明該測定方法適用于葛葉多酚的測定.

2.3單因素實驗

2.3.1溶劑pH對多酚得率的影響

圖2為不同pH值對多酚得率的影響.

由圖2可以看出，在其他實驗條件相同的情況下，葛葉多酚得率在pH=4時最大，達到1.32%.原因可能是植物里的多酚作為鹽類存在，當在酸性條件下容易使單寧酸游離出來，相比酸性環境單寧在堿液中更容易浸出且易氧化，所以選取pH=4的溶劑較合適.

2.3.2?? 提取時間對多酚得率的影響

圖3為不同提取時間對多酚得率的影響.

由圖3可以看出，多酚最高得率為1.41%，提取時間為2.0 h.在2.0 h內得率逐漸增大的原因可能是在時間較短的情況下，葛葉與水的接觸時間不夠，并沒有從葛葉中提取出全部的產物.在2.0 h后下降是因為已經提取出的多酚接觸空氣時間過長，在高溫下容易被氧化，所以得率會逐漸地減小[25].選擇時間2.0 h較合適.

2.3.3料液比對多酚得率的影響

圖4為不同料液比對多酚得率的影響.

由圖4可以看出，在料液比1∶30處多酚得率最大為1.42%.原因可能是當料液比低時，水與多酚會有一個濃度差，可以加快多酚的溶解提取.隨著料液比的增加，溶劑增大濃度減小，濃度差會有一個動態平衡，得率就會趨于平緩.因此，選擇料液比為1∶30較合適.

2.3.4提取溫度對多酚得率的影響

圖5為不同提取溫度對多酚得率的影響.

由圖5可知，最高點也是得率最大的點在70 ℃，得率為1.98%.在50 ℃～70 ℃，多酚得率曲線上升趨勢明顯.多酚得率升高的原因可能是在溫度較低時，對于提取物沒有達到最優的實驗條件，多酚的溶解速度不高.在70 ℃后下降可能是因為多酚的浸出速度達到了一個平衡，溫度過高反而使酶蛋白受熱發生變性，減少了多酚的含量[26].選取提取溫度為70 ℃較合適.

2.3.5提取次數對多酚得率的影響

圖6為不同提取次數對多酚得率的影響.

由圖6可看出，隨著提取次數的增加，葛葉中多酚的得率越來越小.在同樣的實驗條件下，對葛葉多酚第1次的提取得率為1.81%，第2次提取時多酚得率急劇下降，為0.41%.原因是經過2次提取葛葉中的多酚類化合物基本已浸出，為降低能耗以及避免多次提取造成多酚損失[27]，所以提取2次為宜， 2次提取多酚得率共為2.22%.

2.3.6單因素實驗小結

實際上葛葉比葛根的多酚含量相對較少，但是經過單因素數據分析可以看出，采用提取時間2 h、提取pH值為4、料液比1∶30、提取次數2次時葛葉多酚提取條件最優，在此條件下葛葉多酚得率可達2.22%.在此條件下葛葉的多酚含量相對較多，可用于后續抗氧化性檢測.

2.4葛葉的抗氧化活性結果分析

2.4.1DPPH·清除能力測定結果

圖7為不同質量濃度的沒食子酸標準液和樣液對DPPH·清除率的影響.

由圖7結果可知，在實驗測定的質量濃度范圍內，樣液與沒食子酸標準液對DPPH·的清除率是隨著質量濃度增加而增加.在質量濃度小于1.5 mg/mL時，對DPPH·的清除率較為明顯，原因是樣液和沒食子酸一樣含有供氫體，可還原氧化性的自由基，從而終止自由基連鎖反應，之后清除率變化開始平緩沒有大幅度的變化，可能是試液中的有效物質被氧化[8].

2.4.2清除羥基自由基·OH清除能力測定結果

圖8為不同質量濃度的沒食子酸標準液和樣液對·OH清除率的影響.

由圖8結果可知，沒食子酸標準液對于羥基自由基的清除率變化相對于樣液來說是相對平緩的，標準液在實驗濃度范圍內對·OH清除能力基本不變，接近于直線.在低濃度時樣液的清除率較低，隨著濃度的增加曲線呈上升趨勢后逐漸平緩，可能是在反應體系中樣液對羥基自由基的清除能力到達了一定數值，在質量濃度為6 mg/mL處最大清除率為76.24%.

3結論

用福林酚法測定多酚含量，其質量濃度范圍選取在0～4.4 μg/mL，沒食子酸質量濃度與吸光值呈良好的線性關系.對葛葉多酚的提取進行單因素實驗，得出最優的提取多酚的條件為：提取時間2 h，提取pH值為4，料液比1∶30，提取次數2次，在此條件下提取葛葉多酚得率可達2.22%.對葛葉多酚提取液進行精密度、穩定性及加標回收率實驗，結果表明：精密度實驗相對標準誤差為0.27%;穩定性實驗相對標準誤差為0.94%;加標回收率實驗相對標準誤差為1.66%，證明該方法的準確度良好，可應用于葛葉多酚含量的測定.在實驗質量濃度0.5～2.5 mg/mL范圍內葛葉多酚提取液對DPPH·和·OH的最大清除力分別為80.99%和76.24%，證明提取液具有較好的抗氧化性能.

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Extraction technology of polyphenols from Pueraria lobata leaf and its antioxidant properties

TANG Tingfan1，2， ZHU Jiaqing1，2， LI Rongbin1，2， FENG Jun1，2， HUANG Fangli1，2， LIANG Jieting1，2， TIAN Yuhong， LI Xiaohui1，2， CHENG Hao*1，2

（1.School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technoloy， Liuzhou 545006， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technoloy）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： The polyphenols in Pueraria lobata were extracted by reflux method， and the content ofpolyphenols in Pueraria lobata was determined by Folin phenol method. The applicability of? polyphenols in Pueraria lobata was verified by precision， stability and standard addition recovery tests and the antioxidant properties of polyphenols from Pueraria lobata were studied. The single factor experiment was used to study the effect on the yield of polyphenols from Pueraria lobata. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： solvent pH=4， solid-liquid ratio 1∶30， 70 ℃ water bath for 2.0 h， the relative standard error of precision test was 0.27%; the relative standard error of stability test was 0.94%; the relative standard error of recovery experiment was 1.66%; under these conditions， the yield of Pueraria leaf polyphenols was 2.22%. Polyphenols from Pueraria lobata had strong scavenging effect on DPPH· and ·OH， with the maximum scavenging rates of 80.99% and 76.24%， respectively. The process of extracting polyphenols from Pueraria lobata by?? reflux method is reasonable and simple， and the extracted polyphenols have strong antioxidant activity， providing basic research for the development and utilization of Pueraria lobata polyphenols.

Key words： leaves of Pueraria lobata; polyphenols; extraction technology; antioxidation

（責任編輯：黎?? 婭）

收稿日期：2020-09-14

基金項目：廣西研究生教育創新計劃項目（GKYC202012）;國家自然科學基金地區科學基金項目（21662003）;廣西壯族自治區中青年教師

基礎能力提升項目（KY2016YB250）;廣西糖資源綠色加工重點實驗室主任基金（GXTZY201901）;廣西科技大學博士基金項目

（?？撇?4Z06）資助 .

作者簡介：唐婷范，博士，高級實驗師，研究方向：天然產物化工.

通信作者：程昊，博士，副研究員，研究方向：應用化學，E-mail：iamchenghao@126.com.