納米氧化鋅對玉米幼苗生長及酶活性的影響

趙威 陳先良 王長進 余海兵 黃偉東

摘 要：利用竹葉優化合成納米氧化鋅，采用紫外可見吸收光譜法確定納米氧化鋅的最佳合成條件、比色法測定納米氧化鋅對玉米幼苗酶活性影響，并通過電鏡掃描納米氧化鋅的形狀。結果表明，納米氧化鋅最適合成條件為10mL濾液、1mmol/L Zn（CH3COO）2、pH 6、反應溫度60℃，合成的納米氧化鋅為近球形或短桿狀，分散性良好。納米氧化鋅對玉米幼苗生長的影響表現為低濃度促進生長，高濃度抑制生長;低濃度納米氧化鋅能夠為玉米幼苗膜系統提供保護作用;適量添加生物合成的納米氧化鋅能夠促進玉米幼苗生長，提高其抗性。

關鍵詞：竹葉;納米氧化鋅;玉米幼苗;酶活性

中圖分類號 Q945;TB383 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）09-0022-05

與常規材料相比，納米顆粒具有小尺寸、量子尺寸、宏觀量子隧道及表面等四大效應[1-2]。作為21世紀的新興科技，納米技術的飛速發展使納米材料逐漸滲透到人類社會的每個角落。納米氧化鋅作為一種重要的金屬納米顆粒，目前已被廣泛用于電學、光學、化學、生物、食品等領域[3-6]。目前，納米氧化鋅的合成方法主要包括微波輔助等物理途徑[7-8]、液相還原等化學途徑[9-10]、微生物與植物等生物合成途徑3種[11-15]。與物理、化學方法相比，生物合成方法（尤其是利用植物組織為原材料）具有易操作、低能耗、避免有毒試劑使用、低成本等優點，與當前大力倡導的“綠色化學”理念相吻合。

納米材料對植物生長影響主要表現為正向促進與反向抑制作用，主要取決于納米材料種類、濃度、植物種類等因素。關于納米氧化鋅對植物的生長影響研究已有報道，但關于玉米生長的研究卻鮮有報道[16-17]。為此，筆者研究測定生物合成的納米氧化鋅在根數、根（莖葉）長、根（莖葉）干重、酶活性等方面對玉米幼苗生長的影響，以期為玉米生長調節與保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 竹葉采集于安徽科技學院東校區;玉米種子（登海618）購于山東登海種業股份有限公司;Zn（CH3COO）2、HCl、NaOH、Tris、甘油、EDTA、ASA、DTT、GSH、鹽酸、甲硫氨酸、氮藍四唑、核黃素、愈創木酚、H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器 HH-8恒溫數顯水浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）;PHS-3C pH計（上海諾萱科學儀器有限公司）;電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）;TU-1950紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;S-4800 SEM（日立高新技術公司）;高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）;光照培養箱（上海皓莊儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物濾液制備 竹葉洗凈晾干，-20℃保存備用。稱取20g竹葉，加入100mL蒸餾水，95℃水浴加熱30min。植物提取液經濾紙過濾2次，4℃保存備用。

1.3.2 納米氧化鋅合成 按照體積比為1∶9加入上述濾液與蒸餾水，然后添加一定濃度的Zn（CH3COO）2，控溫反應15min，觀察溶液顏色變化。通過調整濾液體積、

Zn（CH3COO）2濃度、pH及反應溫度對其合成過程加以優化。

1.3.3 玉米幼苗培養 選取籽粒飽滿、大小均勻的登海618玉米種子置于以50、100、200、400、800?g/mL納米氧化鋅作為培養液的發芽盒中，以蒸餾水處理作為空白對照，每盒放置100粒玉米種子，隨機排列，重復3次。培養箱溫度25℃，相對濕度70%，每天光照12h。生長7d后，從經過0、50、100、200、400、800?g/mL納米氧化鋅處理的玉米發芽盒中分別取樣并測定各種指標。

1.3.4 生物指標測定 玉米幼苗根長、莖葉長和根數采用測量法;玉米幼苗根鮮重、根干重、莖葉鮮重和莖葉干重采用稱重法。每個處理選取10株幼苗測其根長、莖葉長、根數、根鮮重、根干重、莖葉鮮重和莖葉干重。

1.3.5 玉米幼苗酶活性測定 稱取0.5g植物樣品，置于預冷研缽中，加入5.0mL預冷提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液過濾，并用5mL提取緩沖液沖洗研缽和濾紙，濾液于4℃、4000r/min離心10min，收集上清液，用蒸餾水定容至10mL，低溫保存備用。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法;過氧化物酶（Peroxidase，POD）測定采用愈創木酚比色法;過氧化氫酶（Catalase）測定采用紫外吸收法[18-19]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的測定采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）法[18-19]。

1.4 數據處理 數據統計分析采用DPS數據處理系統軟件，用ANOVA（Analysis of variance，LSD檢驗法）進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 納米氧化鋅生物合成最適合的條件 稀釋后的濾液加入Zn（CH3COO）2后，溶液由淺綠色變為黃色，溶液顏色的改變標志著納米氧化鋅的形成（圖1）。此外，紫外可見吸收光譜結果顯示其最大吸收峰位于393nm，對應于納米氧化鋅的表面等離子體共振（圖2）。

2.1.1 濾液體積 不同體積（1～20mL）的竹葉濾液均能合成納米氧化鋅。紫外可見吸收光譜結果表明，溶液最大吸收峰（A393）隨濾液體積增加呈先增大后減小趨勢，且當濾液體積為10mL時達到最大值（圖3）。因此，確定最佳濾液體積為10mL。

2.1.2 Zn（CH3COO）2濃度 隨著Zn（CH3COO）2濃度的增加，溶液對應的最大吸收峰（A393）有升有降，且在1mmol/L時達到最大值（圖4）。因此，確定最佳Zn（CH3COO）2濃度為1mmol/L。

2.1.3 pH值 溶液酸堿性對納米氧化鋅的合成影響較大，隨著溶液pH值增大，其最大吸收峰（A393）急劇減小，表明酸性條件有利于納米氧化鋅的合成（圖5）。因此，確定最佳pH值為6。

2.1.4 反應溫度 由圖6可知，溫度對納米氧化鋅形成的影響非常顯著。紫外可見吸收光譜結果顯示，溶液最大吸收峰（A393）隨著溫度升高而迅速降低，且當反應溫度為60℃時，溶液吸收峰達到最大值。因此，確定最佳反應溫度為60℃。

2.1.5 SEM與EDS分析 納米氧化鋅預先經超聲充分分散，移液器吸取適當體積滴加在硅片上，噴金處理后置于掃描電子顯微鏡中檢測。由圖7可知，不同放大倍數獲取的納米氧化鋅SEM圖像為近球形或短桿狀，存在少許聚集顆粒。而EDS顯示納米氧化鋅在1keV和9keV附近具有明顯的Zn、O元素吸收峰，其余元素如Si、Fe、K等可能歸因于提取液中的成分。

2.2 不同濃度納米氧化鋅對玉米幼苗生物性狀的影響 由圖8可知，隨著納米氧化鋅濃度的增加，玉米幼苗根數增加，但5個納米氧化鋅濃度間無顯著性差異，其中800?g/mL納米氧化鋅處理的玉米幼苗根數最多（7根），明顯大于對照;50、100、200、400?g/mL納米氧化鋅處理的玉米幼苗根長與對照無顯著性差異，而100、400、800?g/mL納米氧化鋅的處理的玉米幼苗根長與對照有顯著性差異，其中100?g/mL納米氧化鋅處理玉米幼苗根長最長，說明納米氧化鋅對于幼苗根長具有促進作用，但與其濃度無關;5個處理間玉米幼苗的莖葉長無顯著性差異，但與對照均存在顯著性差異，其中50?g/mL納米氧化鋅處理玉米幼苗莖葉長最大，說明納米氧化鋅濃度<200?g/mL時對幼苗莖葉生長無影響，但>200?g/mL時則明顯抑制玉米幼苗莖葉的生長。

由圖9可知，當納米氧化鋅濃度為200?g/mL時，玉米幼苗根鮮重開始低于對照，納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根鮮重最低（4.41g），較對照減少了22.91%;5個處理玉米幼苗根干重顯著小于對照，且5個處理之間也存在顯著性差異，其中濃度為800?g/mL時幼苗根干重最低（1.87g），較對照減少了33.92%。由此可見，納米氧化鋅對玉米幼苗根生長具有抑制作用，且隨著納米氧化鋅濃度的增加，抑制作用越強。

由圖9可知，經納米氧化鋅處理后，玉米幼苗莖葉的鮮重和干重均高于對照，并且當納米氧化鋅濃度為50?g/mL時，玉米幼苗莖葉的鮮重和干重最大，較對照分別增加35.39%和25.78%。由此可見，納米氧化鋅對玉米幼苗莖葉的生長具有促進作用，并且當納米氧化鋅溶液濃度為50?g/mL時對幼苗莖葉生長的促進作用最大。

2.3 不同濃度納米氧化鋅對玉米幼苗抗酶活性與丙二醛含量的影響

2.3.1 幼苗根部 由圖10可知，每個處理間玉米幼苗根部的SOD存在顯著性差異，當納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根部SOD活性最大，當納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部SOD活性最小，且與對照無顯著性差異?？傮w而言，幼苗根部SOD活性隨納米氧化鋅濃度增大而增大。POD和CAT能夠清除過量的H2O2，防止膜脂質過氧化作用。由圖10可知，玉米幼苗根部POD活性隨著納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后減小的趨勢，當納米氧化鋅濃度為200?g/mL時POD活性達最大值，且顯著大于對照。由圖10可知，玉米幼苗根部CAT活性隨著納米氧化鋅濃度的增大而減小，納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部CAT活性最大，納米氧化鋅濃度為800?g/mL時幼苗根部CAT活性較對照明顯減小，說明當納米氧化鋅濃度為800?g/mL時納米氧化鋅對玉米幼苗的CAT起抑制作用。由圖10可知，幼苗根部MDA值隨納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后下降的趨勢，當納米氧化鋅濃度為400?g/mL時幼苗根部MDA值最大，且與對照無顯著性差異;當納米氧化鋅濃度為50?g/mL時幼苗根部MDA值最小，且明顯小于對照，說明當納米氧化鋅濃度達到400?g/mL時會損害玉米根的細胞膜系統，當納米氧化鋅濃度為50?g/mL時對玉米幼苗根的細胞膜系統具有保護作用。

2.3.2 幼苗莖葉 SOD能夠清除超氧自由基（O2-），與CAT、POD等酶協同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害，從而減少自由基對有機體的毒害。由圖11可知，經過不同濃度納米氧化鋅處理后，玉米幼苗莖葉的抗氧化酶表現出不同的變化趨勢。幼苗莖葉的SOD和POD活性隨著納米氧化鋅濃度的增加呈先增加后減小的趨勢，在400?g/mL納米氧化鋅處理下的幼苗莖葉SOD和POD活性最高，且顯著高于對照，其他濃度處理下的幼苗莖葉SOD和POD活性小于對照;CAT的活性隨著納米氧化鋅濃度的增加也呈先增加后減小的趨勢，當納米氧化鋅濃度為200?g/mL時CAT活性最大，且明顯大于對照，經過納米氧化鋅處理后的幼苗莖葉CAT活性均大于對照;玉米幼苗莖葉的MDA含量隨納米氧化鋅濃度的增加呈先增大后減小趨勢，在200?g/mL納米氧化鋅處理下的MDA含量最大，且顯著大于對照，其他4個處理MDA含量均小于對照，其中50?g/mL納米氧化鋅處理下的MDA含量最小。

3 結論與討論

本研究首次利用竹葉合成納米氧化鋅，證實竹葉提取液可以充當新型反應物用于制備納米氧化鋅。以植物組織為原材料的生物合成方法克服了傳統的物理、化學合成途徑的弊端。通過調整濾液、Zn（CH3COO）2濃度、pH值以及反應溫度，探索出基于竹葉制備納米氧化鋅的最優條件。

納米氧化鋅對幼苗的根數、根長具有促進作用，800?g/mL納米氧化鋅處理下的幼苗根數最多，而50?g/mL納米氧化鋅處理下幼苗根長達到最大。但納米氧化鋅對玉米幼苗地上部分影響不大，甚至當納米氧化鋅濃度大于200?g/mL時，納米氧化鋅對玉米幼苗地上部分生長還存在抑制作用。Xiang等[16]報道的納米氧化鋅影響大白菜及Singh等[17]報道的納米氧化鋅影響菠菜也得出類似結論。SOD與CAT、POD等酶協同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害，從而減少自由基對有機體的毒害。本研究中一定濃度的納米氧化鋅對玉米幼苗SOD、POD、MAT的活性具有促進作用，但納米氧化鋅濃度過大會嚴重降低SOD、POD、MAT的活性，其中200?g/mL是納米氧化鋅最佳濃度，該濃度下幼苗莖葉SOD、POD、MAT的活性均較高，且200?g/mL納米氧化鋅處理下幼苗根莖葉中MDA含量相對較低，說明在200?g/mL納米氧化鋅處理后玉米幼苗的抗氧化性最強。

此外，竹葉提取液中一些活性物質具備一定的消炎抗菌作用，以其為原材料合成納米顆粒在抑制病原細菌、病原真菌等方面具有一定應用潛力。

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（責編：徐世紅）