蓮藕提取物體外抗氧化作用研究

麻玉瑩， 邊祥雨， 于藝婧， 楊忍忍， 高蔚娜， 郭長江

(軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津，300050)

蓮藕是植物蓮的根莖，是亞洲地區常見的食藥兩用植物。近年來，人們對蓮藕的功能成分進行了廣泛的研究，為闡明蓮藕的醫藥特性以及驗證其作為功能性食品的有效性提供了可靠的證據。據報道，蓮藕具有多種藥理作用，如降血糖、護腎、抗炎、止血作用，此外還具有保肝護肝、精神藥理和免疫調節作用〔1〕。 探索天然抗氧化劑以抵抗氧化應激已成為近年來的研究熱點〔2〕。目前關于蓮藕的抗氧化功能多集中于藕節部位，關于蓮藕可食部提取物的抗氧化功能報道較少。體外抗氧化作用包括自由基清除率、抑制脂質過氧化等，常采用化學法或建立細胞模型進行評價。本研究以蓮藕可食部提取物為研究材料，測定蓮藕提取物的總抗氧化力及DPPH、羥自由基清除率；選用C2C12細胞，以H2O2誘導產生氧化損傷，檢測細胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量來評價蓮藕提取物的抗氧化作用，為蓮藕產業的深加工奠定基礎，為今后抗氧化產品的研發開辟新徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器蓮藕(天津市王頂堤菜市場)；小鼠成肌(C2C12)細胞(美國ATCC細胞庫)；胎牛血清、CCK-8(美國Invigentech公司)；蘆丁標準品(上海源葉生物科技有限公司)；抗壞血酸(阿拉丁試劑有限公司)；MDA、GSH-Px、CAT、SOD測試盒(南京建成生物工程研究院)；DPPH、羥自由基清除能力、總抗氧化能力檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。 細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；超級酶標儀(美國 Bio Tek 公司)；旋渦混合器(無錫杰瑞安儀器設備有限公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1蓮藕提取物的制備 將購買的新鮮蓮藕洗凈、晾干后去皮，將日常食用部分切成小塊，采用榨汁機榨汁后，對新鮮蓮藕汁進行真空冷凍干燥，干燥后得到蓮藕粉末狀樣品。按照文獻〔3〕方法進行提取。

1.2.2細胞培養 細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的培養基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養，當細胞融合至80%以上后，進行傳代。

1.2.3蓮藕提取物清除DPPH、羥自由基作用及總抗氧化能力的檢測 按照試劑盒說明書，測定蓮藕提取物對DPPH、羥自由基清除作用及總抗氧化能力。設置蘆丁與抗壞血酸(VC)為陽性對照。

1.2.4蓮藕提取物對H2O2誘導C2C12細胞氧化損傷的保護作用 建立氧化損傷模型：選擇對數生長期的C2C12細胞，接種于96孔板中，稀釋細胞個數為5×104個/孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后，棄去舊培養基，然后進行分組：空白對照組與梯度濃度的H2O2處理組(0、100、200、400、600、800、1000 μmol/L)，空白對照組加入DMEM進行培養，H2O2處理組加入各濃度的H2O2進行培養，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1h，通過酶標儀于450 nm波長下測定OD值，根據CCK-8試劑盒說明書計算細胞存活率〔4〕，確定H2O2適宜濃度。 CCK-8法檢測蓮藕提取物對細胞的保護作用：選擇對數生長期的C2C12細胞，接種于96孔板中，稀釋細胞個數為5×104個/孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后，棄去舊培養基，然后進行分組：空白對照組、H2O2模型組、不同濃度的蓮藕提取物保護組(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)。按照上述分組，首先不同濃度的蓮藕提取物要預先處理12 h，然后加入200 μg/mL H2O2溶液(根據上文結果測得)處理6 h，空白對照組加入DMEM進行培養，H2O2模型組加入200 μg/mL H2O2溶液進行培養，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h，用酶標儀測出各孔OD值，根據CCK-8試劑盒說明書計算細胞存活率，確定蓮藕提取物適宜濃度。

1.2.5蓮藕提取物對H2O2誘導C2C12細胞SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的影響 細胞SOD、CAT、GSH-Px活性與MDA含量測定：選擇對數生長期的C2C12細胞，稀釋細胞個數為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔接種2 mL。培養24 h后進行分組：正常對照組、H2O2模型組、蓮藕提取物組。細胞經過不同樣品和H2O2處理后，收集培養液進行各指標的測定。分別用試劑盒提供的方法測定細胞內SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA含量。

2 結果

2.1 蓮藕提取物清除DPPH自由基、羥自由基能力與總抗氧化力如圖1所示，當濃度為5mg/ml時，蓮藕提取物具有較好的清除DPPH、羥自由基的能力與總抗氧化力。

圖1 DPPH自由基、羥自由基清除能力與總抗氧化力LRE：蓮藕提取物；Rutin：蘆??；VC：抗壞血酸a：DPPH自由基清除率；b：羥自由基清除率；c：總抗氧化力*P<0.05,**P<0.01

2.2 蓮藕提取物對H2O2作用下C2C12細胞存活率的影響如圖2所示，H2O2對細胞的氧化損傷隨濃度的增大而增強，一般應選擇細胞存活率在50%～70%范圍內，便于試驗觀察研究〔5〕。因此，選擇200μmol/L H2O2進行后續細胞損傷保護試驗。

圖2 不同濃度H2O2對C2C12細胞存活率的影響

如圖3所示，在C2C12細胞中，不同濃度的蓮藕提取物預處理24h，對H2O2誘導的細胞損傷有明顯的保護作用，且當蓮藕提取物濃度為40 mg/mL時，對C2C12細胞的保護作用基本達到上限(P<0.01)，當蓮藕提取物濃度為100 mg/mL時，保護作用反而下降。上述結果表明，一定濃度的蓮藕提取物能夠減輕H2O2暴露造成的細胞氧化損傷。

圖3 蓮藕提取物對H2O2作用下C2C12細胞存活率的影響*P<0.05,**P<0.01

2.3 蓮藕提取物對H2O2誘導的C2C12細胞MDA產生的抑制作用我們選擇保護作用最為顯著的蓮藕提取物濃度為40 mg/mL對細胞進行處理，實驗結果表明(如圖4所示)，與對照組細胞相比，H2O2模型組細胞MDA含量明顯增加(P<0.01)；與H2O2模型組細胞相比，蓮藕提取物處理組可以明顯減少H2O2暴露導致的C2C12細胞的MDA產生(P<0.01)。

2.4 蓮藕提取物對H2O2誘導的C2C12細胞抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)活性的影響SOD、CAT和GSH-Px 是機體內主要的抗氧化酶。我們選擇保護作用最為顯著的蓮藕提取物濃度為40mg/mL對細胞進行處理，結果表明(如圖5所示)，與對照組相比，H2O2暴露可以顯著降低C2C12細胞SOD、GSH-Px與CAT活性(P<0.05)；蓮藕提取物處理后可以顯著增加SOD、GSH-Px與CAT活性，與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。以上結果提示蓮藕提取物可以通過保護抗氧化酶活性來減輕H2O2所致的氧化應激損傷。

圖 4 蓮藕提取物對H2O2引起的C2C12細胞脂質過氧化產物 MDA的影響figure_titleControl：空白對照組；Model：H2O2模型組；LRE：蓮藕提取物組**P<0.01

圖5 蓮藕提取物對H2O2引起的C2C12細胞抗氧化酶活性的影響Control：空白對照組；Model：H2O2模型組；LRE：蓮藕提取物組**P<0.01

以上結果表明，蓮藕提取物能抑制H2O2誘導的C2C12細胞氧化損傷，對H2O2誘導的C2C12細胞具有一定的保護作用，能夠提高細胞SOD、CAT和GSH-Px活性，降低MDA含量，表明蓮藕提取物對C2C12細胞有明顯的抗氧化作用。

3 討論

氧化應激是指自由基產生與抗氧化防御之間的不平衡，與許多慢性退行性疾病有關。目前，水果、蔬菜及其抗氧化劑提高人體內抗氧化水平的研究已引起廣泛關注，其抗氧化活性的產生可歸因于多種機制。MDA是脂質過氧化的酶生物標志物和終產物，細胞膜釋放的MDA能與蛋白質和核酸發生反應，引起交聯聚合，使蛋白質無法正常合成，MDA還能引起細胞膜結構和功能的異常，從而導致機體生理狀態的異常，故MDA可以間接顯示機體清除氧化產物能力和抗氧化活性〔6〕。SOD、CAT和GSH-Px 是機體內主要的抗氧化酶，所有的細胞都具有天然的抗氧化防御系統來中和活性氧的影響，其中，SOD、GSH-Px和CAT起核心作用，SOD將超氧陰離子轉化為H2O2和O2，H2O2的毒性比超氧物小得多，SOD能夠有效清除超氧陰離子自由基，通過抗氧化應激來緩解疲勞，是最重要的自由基清除劑之一，其活性是自由基清除的間接指標，對維持體內ROS的動態平衡至關重要〔7-8〕；GSH-Px使用GSH作為氫供體將H2O2還原為H2O和O2，GSH-Px是細胞內對抗活性氧的主要酶抗氧化防御物質，在減輕細胞氧化損傷中起著重要作用；CAT將H2O2分解為H2O和O2，以保護機體細胞穩定的內環境和細胞的正常功能〔9-11〕。因此，本研究選用C2C12細胞，以H2O2誘導產生氧化損傷，通過檢測細胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量，來評價蓮藕提取物的體外抗氧化作用。

本研究結果顯示，H2O2暴露導致C2C12細胞存活率降低，各劑量蓮藕提取物預處理之后，各組細胞活力明顯高于H2O2模型組，表明蓮藕提取物H2O2誘導C2C12細胞具有較好的保護作用，減輕了H2O2引起的細胞損傷程度；H2O2暴露后細胞抗氧化酶SOD 、CAT和GSH-Px 活性顯著降低及細胞脂質過氧化產物MDA 明顯增加，加入蓮藕提取物進行預保護后，細胞SOD活性增強，SOD是機體抵抗自由基的主要酶防御系統，SOD活性的增加表明機體正在進行抗氧化，以防止自由基誘導的損傷，減少細胞損傷；同時，CAT和GSH-Px活性顯著增強、MDA含量減少，顯示蓮藕提取物對于C2C12細胞氧化損傷具有較好的保護作用，能通過降低脂質過氧化產物的產生、提高抗氧化酶活性來抑制H2O2誘導的細胞氧化損傷。以上研究結果將有助于蓮藕作為食源性抗氧化劑的開發應用，并為氧化應激相關疾病的預防與治療提供理論依據。