大鼠多重細菌感染肺炎模型的建立

董輝偉， 陳鄭珊， 王麗芳， 金 敏， 李君文， 楊 棟

(軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所， 天津 300050)

肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，它可由多種微生物引起，包括細菌、病毒和真菌等，是全世界發病率和死亡率最高的疾病之一〔1-2〕。在住院過程中，尤其是在重癥監護室(Intensive care unit，ICU)，50%的危重癥患者發生院內感染，其中，呼吸系統感染占60%以上，使得患者的死亡風險成倍增加〔3〕。研究表明，來自受污染的示波器、旁路機、自來水和透析液等相關醫療設施或試劑的革蘭氏陰性菌傳播頻率越來越高〔4〕，各種導管的使用使患者易受革蘭氏陰性桿菌、金黃色葡萄球菌和放線菌等病原體侵害，氣管插管更是極易使患者患呼吸機相關性肺炎。 病原體通常通過患者吸入口咽部分泌物進入下呼吸道，是否發展為肺炎在很大程度上取決于患者的吸液量、吸入頻率以及吸入病原菌的接種量相對于宿主免疫的毒力。為探索細菌性感染肺炎的機制，首先要建立相關細菌的肺炎動物模型。目前，各文獻報道的動物肺炎模型多是單一菌種感染，而臨床常見的肺炎感染，尤其是醫院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)，往往都是多重細菌感染〔5〕。根據中國耐藥基因監測網報告，2019年全國臨床分離菌株排前兩位的分別為大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)，并且肺炎克雷伯菌同樣是呼吸系統分離菌株最常見的細菌〔6〕。本文通過氣管滴注大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌建立大鼠肺炎模型，更充分地模擬多重細菌感染性肺炎。

1 材料與方法

1.1 菌種大腸埃希菌MG1655(E.coli)，具有四環素抗性(本實驗室保存)；肺炎克雷伯菌ATCC35657(Kpn)，具有美羅培南抗性(本實驗室改造)。接種前過夜培養，離心后使用滅菌PBS重懸，使用多功能酶標儀通過OD600 nm值測定，調節濃度至109 CFU/mL。

1.2 實驗動物及分組21只雄性SPF級SD大鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)，體質量180-200 g，隨機分為7組，每組3只,觀察不同時間大鼠肺部感染情況。大鼠自由飲無菌水和進食滅菌食物，屏障設備內飼養條件嚴格控制 (溫度:20～25℃;濕度:50%～70%;光照/黑暗:12 h/12 h)，實驗過程對動物的處理符合軍事醫學研究院動物倫理審查標準。

1.3 動物實驗與樣本采集大鼠經乙醚吸入麻醉后，將其豎立固定在操作臺，使用鑷子拉出大鼠舌頭, 用移液器從大鼠氣管注入300 μL等體積E.coli與Kpn混合菌液。接種后使大鼠保持直立位約30 s,以保證接種菌液被充分吸入肺部〔7〕。 在不同時間點(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、8 h、72 h)，使用戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠殺鼠取材，其中0 h組為對照組，灌菌后立即取材。通過心臟采血，加入EDTA抗凝管做血常規分析，而后將大鼠右上肺通過無菌縫合線結扎，只灌洗大鼠肺部其余部分，使用10 mL注射器共吸取20mL(第1次8 mL、第2次6 mL，第3次6 mL)滅菌PBS溶液對肺內部進行反復灌洗，取得支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)樣品并立即置于冰上，留取5 mL用于抗性篩查培養，其余全部凍存于-80 ℃冰箱。將結扎的右上肺切除，放入4%多聚甲醛固定以進行蘇木精和伊紅(H&E)染色及病理分析。

1.4 平皿傾注法細菌計數分別將灌洗液取出1 mL加入9 mL滅菌PBS中稀釋10倍，依此方法將灌洗液稀釋成4個濃度梯度。將不同濃度梯度灌洗液分別取出1mL使用傾注法進行抗生素抗性篩選。E.coli具有四環素抗性，但不具有美羅培南抗性，Kpn具有美羅培南抗性，但不具有四環素抗性。因此，含有四環素終濃度為60 mg/mL的平皿將篩選出E.coli，含有美羅培南終濃度為3 mg/mL的平皿將篩選出Kpn。

1.5BALF炎癥因子檢測使用ELISA試劑盒(四正柏生物科技有限公司)通過酶標儀檢測BALF中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1-α(Interleukin-1α，IL-1α)、白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)水平變化。

1.6 統計分析使用OriginPro 8.5對菌落計數結果進行趨勢擬合分析。使用GraphPad Prism 7對不同時間段血細胞計數及BALF炎癥因子進行One way ANOVA統計檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 平皿傾注法BALF菌落計數經平皿抗性篩查培養，發現E.coli數量(圖1A)、Kpn數量(圖1B)及兩者總數量(圖1C)在大鼠肺部呈指數下降，尤其在前6個小時減少速度最快，在72小時，大鼠肺部大部分加入細菌已被清除。

圖1 BALF菌落培養計數注：A.E.coli數量 B.Kpn數量 C.E.coli與Kpn總數量

2.2 血液中免疫細胞檢測與對照組比較，各組血液中白細胞(WBC)、中性粒細胞(Neu)、淋巴細胞(Lym)水平均略有升高，在48 h相對較高，而后在72 h出現下降(圖2A、圖2B、圖2C)，但無統計學差異。

圖2 大鼠血細胞計數注：A.白細胞數量 B.中性粒細胞數量 C.淋巴細胞數量

2.3BALF炎癥因子變化通過對大鼠BALF中炎癥因子TNF-α、IL-1α、IL-6水平檢測發現，與對照組相比，BALF中上述炎癥因子均呈現先升高后下降的趨勢。其中，TNF-α、IL-6在3 h、6 h和對照組有顯著差異，且在6 h左右達到峰值；IL-1α在6 h、12 h和對照組有顯著差異，也在6 h左右達到峰值。見圖3。

圖3 BALF炎癥因子變化注：A.TNF-α濃度 B.IL-1α濃度 C.IL-6濃度

2.4 肺組織病理分析對不同時間組肺組織固定并進行H&E染色發現，與對照組正常肺組織結構相比，3 h肺泡間質輕微增厚,但未見明顯炎癥細胞浸潤；6h部分肺泡萎縮塌陷，肺組織輕度實質化并可見明顯炎癥細胞浸潤；隨時間延長，肺組織病理損傷進一步加重，在48 h，肺組織整體結構異常，肺泡萎縮塌陷進一步加重，肺輕度實質化伴明顯炎癥細胞浸潤(圖4)；72 h肺損傷與48 h基本一致。

圖4 大鼠肺組織病理注：A.0 h B.3 h C.6 h D.48 h

3 討論

醫院獲得性肺炎是肺炎最常見的類型，在歐洲每年發生多達50萬例〔8〕。在我國，根據Xiong等報道，在696例醫院感染患者標本中共檢出病原菌1872株,其中下呼吸道感染占比約40%，感染的細菌中又以Kpn為主，占比約20%〔9〕。根據Che等報道，臨床108例多重耐藥菌感染的患者中,共檢出病原菌130株,其中呼吸系統感染占比75%，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌為主〔10〕。 HAP往往導致嚴重的醫療后果，包括住院時間延長，長期體質虛弱和抑郁以及死亡率增加〔11〕。HAP也給患者帶來沉重的經濟負擔，在歐洲，每次治療的平均費用為4萬歐元，在美國，每年的醫療費用達到80億美元〔12〕。當前，預防和治療HAP主要是通過使用抗生素減少呼吸系統細菌載量〔5〕。但HAP往往感染不止一種細菌，尤其隨著各種耐藥細菌病原體的出現，HAP的治療將變得更加困難，其中在重癥患者中，臨床治愈率通常不超過70%〔13〕。在未來十年內，預防和治療HAP的效率將變得更低〔14〕。 建立有效的動物感染模型是研究細菌性肺炎的基礎。本實驗中大鼠氣管滴注加入的細菌含有特定抗生素抗性，用含特定抗生素的培養基能夠較好地區分出加入細菌在大鼠肺部的數量變化，并排除支氣管土著菌或環境中其他細菌的干擾。本研究發現，E.coli和Kpn在大鼠氣管滴注后均快速被殺滅或清除，尤其在前6小時減少最快，充分地反映了呼吸系統對外來病原體強大的防御能力。 目前對于不同品系大鼠的血細胞數量并沒有統一的參考標準，與人血液中性粒細胞在白細胞中占比高不同，大鼠白細胞中，淋巴細胞占比更高，這與以往文獻報道一致〔15-16〕。本實驗中，大鼠肺部染菌后，血細胞中白細胞總數、中性粒細胞及淋巴細胞計數與對照組相比雖然沒有統計學差異，但均略有升高，且在48 h達到相對較高水平，在72 h出現下降。

在大鼠感染細菌后，淋巴細胞等免疫細胞活化并釋放多種細胞因子。TNF-α是由單核巨噬細胞、樹突狀細胞等產生的具有廣泛生物學活性的多肽調節因子，可被多種刺激物誘導發生，在炎癥反應的啟動中發揮關鍵作用。白細胞介素是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子。其中，IL-1α能夠促進趨化因子及其他細胞因子的分泌,誘導其下游的炎癥介質合成及表達，激發炎癥的級聯反應，擴大炎癥反應等〔17〕；IL-6可起到刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖，刺激細胞毒性T細胞活化，增強自然殺傷細胞的裂解功能等。我們發現，在BALF中炎癥因子反映炎癥變化較迅速，在肺部染菌后3 h即開始出現，6 h左右達到峰值。隨接種時間延長，大鼠肺內外源細菌被逐漸清除，炎癥因子水平也不斷下降，基本能夠反映肺部早期急性炎癥感染變化。

經肺組織病理分析發現，在染菌后3 h即出現肺泡間質輕微增厚，但未見炎癥細胞浸潤，6 h可見明顯炎癥細胞并出現肺組織輕度實質化改變。之后雖然大鼠肺內加入的細菌數量已經大量減少，但是肺組織病理變化卻進一步加重。肺泡萎縮塌陷、肺實質化進一步加重并伴明顯炎癥細胞浸潤。反映了在大鼠肺部細菌被清除之后，其炎癥反應帶來的損傷并沒有隨之減弱，反而在短期內會進一步加重。

本實驗通過氣管滴注大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌混合菌液，探究了外源細菌在大鼠肺部的數量變化情況，對支氣管與肺泡灌洗液中炎癥因子水平與肺組織病理分析，結果表明大鼠肺部炎癥明顯，為后續研究多重細菌感染性肺炎奠定了基礎。