慢性乙肝肝硬化患者常見腸道菌群失衡與肝功能分級的關系研究

武 瓊，李 艷，張 寧，張 錦

（1.榆林市第二醫院消化內科，榆林 719000；2.延安大學附屬醫院婦科，延安 716000；3.延安大學附屬醫院消化內科，延安 716000）

腸道菌群與肝臟關系密切，兩者不僅通過門靜脈及淋巴系統建立直接的解剖學關聯，同時腸道菌群輔助消化吸收，提供維生素K 等提高肝臟枯否細胞數量及功能，而肝臟則通過分泌性免疫球蛋白A、膽汁酸等維持腸道菌群生態平衡［1］?，F階段研究［2］顯示腸道菌群失衡在肝硬化及多種相關并發癥的發生及發展中起一定作用，但直接分析慢性乙型病毒性肝炎（Chronic Viral Hepatitis B，CHB）肝硬化患者腸道菌群失衡與肝功能Child-Pugh 分級相關性的報道尚少，基于此，本研究應用實時熒光定量PCR 技術檢測腸道糞便總DNA，通過定量分析方案探討了該問題，報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗對象 2017 年1 月～2020 年12 月我院收治的CHB 肝硬化患者208 例及同期健康體檢者100 例為對象，開展對照研究，本研究已獲得院倫理委員會批準，納入患者均知情且簽署同意書。CHB 患者納入標準：病歷及診斷資料完整，且均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 更新版）》［3］中CHB 肝硬化診斷相關標準；年齡18～65 歲；近1 個月內未應用抗生素、微生態調節劑等影響腸道微生態的藥物。排除標準：近1 個月除HBV 外其它病毒、細菌及真菌感染；近1 個月內出現腹瀉等胃腸道疾??；飲食習慣特殊者，如素食者。健康對照者均為常規檢查正常者，同時排除飲食習慣特殊及近1 個月有可能影響腸道菌群行為或疾病者。

1.2 分組方案 根據Child-Pugh 分級結果，將患者中分級A 級者納為A 級組，B 級者納為B 級組，C 級者納為C 級組，A 級組共101 例，男71 例、女30 例，年齡21～63 歲、平均（47.88±12.51）歲，乙肝病程8 個月～7年、平均（2.44±1.01）年，伴出血24 例；B 級組共86 例，男61 例、女25 例，年齡23～65 歲、平均（48.12±13.17）歲，乙肝病程2～15 年、平均（6.22±1.13）年，伴出血40例，伴腹水21 例，伴肝性腦病2 例；C 級組共21 例，男14 例、女7 例，年齡25～65 歲、平均（48.37±12.51）歲，乙肝病程5～20 年、平均（11.71±3.05）年。對照組共100 例，男64 例、女36 例，年齡18～65 歲、平均（48.50±12.37）歲，伴出血32 例，伴腹水27 例，伴肝性腦病7例。4 組性別、年齡對比，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.3 實驗步驟 ①糞便采集。所有對象的糞便標本均于排便后1h 內應用一次性采樣勺采集，稱取250mg 分裝于EP 管，凍存于-80℃超低溫冰箱，采集過程避免尿液污染。②總DNA 提取。主要試劑盒為天根生化科技生產的糞便基因組DNA 提取試劑盒DP328，參考試劑盒說明書，提取糞便總DNA，每份DNA 樣品取2μl，應用分光光度計（SmartSpec 3000，美國Bio-Rad）檢測樣本質量。③實時熒光定量PCR 分析。主要分析常見菌屬，包括腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數量，針對細菌16s rRNA V4～V6 區設計對應均屬特異性引物，構建質粒，通過熒光定量PCR技術檢測對應菌屬數量，單位按lg copies/g 濕糞表示。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0 處理數據，計量資料均按mean±SD 表示，多組間對比采用重復測量的方差分析和SNK 檢驗，菌種數量與Child-Pugh 分級采用Spearman 相關性分析，菌種數量對診斷Child-Pugh 分級B～C 級的價值采用ROC 曲線分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組間實時熒光定量PCR 結果 經電泳圖引物特異性檢測，未見明顯非特異性擴增，提示各細菌的引物特異性良好，能夠用于實時熒光定量PCR。分析顯示，6種細菌在不同組間表達均有明顯差異，P<0.05。見表1。

表1 四組間時候死熒光定量PCR結果對比（lg copies/g濕糞）

2.2 菌群數量與肝功能Child-Pugh 分級相關性分析對照組、A 級組、B 級組、C 級組分別賦值為0～3，經Spearman 相關性分析，腸桿菌、腸球菌數量與Child-Pugh分級正相關（P<0.001）；擬桿菌、梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌均與Child-Pugh 分級負相關（P<0.001）。見表2。

表2 菌群數量與肝功能Child-Pugh分級相關性分析

2.3 不同菌群數量對診斷肝功能Child-pugh 分級B ～C 級價值 R O C 曲線顯示腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、梭菌屬、乳酸桿菌、雙歧桿菌均能有效預測C h i l d-P u g h 分級B ～C，曲線下面積分別為0.817（P<0.001，95%CI=0.767～0.868）、0.800（P<0.001，95%CI=0.748～0.852）、0.747（P<0.0 0 1，9 5%C I=0.6 9 1 ～0.8 0 3）、0.7 9 2（P<0.0 0 1，9 5%C I=0.7 3 9 ～0.8 4 5）、0.7 6 2（P<0.001，95%CI=0.707～0.808）、0.932（P<0.001，95%CI=0.900～0.964）。進一步分析可知：腸桿菌數量≤6.05 單位時，其診斷特異度1.000，≥6.40 時診斷敏感度1.000，最佳截斷值6.30 單位，此時敏感度0.797，特異度0.843；腸球菌數量≤5.09 單位時，其診斷特異度1.000，≥5.83 單位時其診斷敏感度1.000，最佳截斷值5.43 單位，此時敏感度0.778，特異度0.810；擬桿菌數量≤5.84單位時，其診斷敏感度1.000，≥6.12 單位時診斷特異度1.000，最佳分界值6.08 單位，此時敏感度0.601，特異度0.850；梭菌屬≤6.38 單位時，其診斷敏感度1.000，≥6.91 單位時診斷特異度1.000，最佳分界值6.69 單位，此時敏感度0.731，特異度0.810；乳酸桿菌≤3.76 單位時，其診斷敏感度1.000，≥4.31 單位時診斷特異度1.000，最佳分界值4.05 單位，此時敏感度0.804，特異度0.634；雙歧桿菌≤5.12 單位時，其診斷敏感度1.000，≥5.72單位時診斷特異度1.000，最佳分界值5.44 單位，此時敏感度0.928，特異度0.895。見圖1。

圖1 不同菌群數量對預測肝功能Child-Pugh分級B～C級價值

3 討論

CHB 肝硬化患者往往存在明顯的免疫功能紊亂，機體免疫功能下降，腸道難以抵抗外侵菌定植及繁殖，因此腸道菌群生態平衡被打亂［4］。本研究納入208 例患者，研究發現CHB 患者腸道菌群失衡，表現為腸桿菌屬、腸球菌屬數量上升，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數量下降。張雯等［5］報道納入65 例肝硬化患者和65 例健康人群，對比顯示肝硬化患者腸道腸球菌、腸桿菌明顯上升，雙歧桿菌明顯下降。這提示CHB 致肝功能損傷后，革蘭陰性菌明顯增加，這會影響腸道的輔助消化功能，且紊亂菌群可能直接上行至上消化道，釋放內毒素，后者進入門靜脈則會影響肝臟廓清能力，引發內毒素血癥，加重肝?。?］。這提示改善腸道菌群紊亂可能有助于提升CHB 及肝硬化患者肝功能，從而提升疾病療效。曹玲等［7］利用枯草桿菌腸球菌二聯活菌膠囊治療63 例肝炎后肝硬化失代償期患者，顯示能夠有效降低內毒素水平，從而改善患者預后；石勇明等［8］利用雙歧桿菌四聯活菌片輔助治療乙肝后肝硬化患者，結果顯示能夠進一步改善患者肝功能；梁惠［9］等報道也有類似結論。

腸道菌群紊亂和CHB 肝硬化患者肝功能下降可通過負性循環彼此促進［10］，導致患者肝功能持續下降，這提示腸道菌群紊亂與患者Child-Pugh 分級也有一定相關性。本研究發現隨Child-Pugh 分級的上升，患者腸道菌群失衡明顯加劇，腸桿菌、腸球菌數量與Child-Pugh 分級正相關，擬桿菌、梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌均與Child-Pugh 分級負相關。唐源淋等［11］報道也顯示腸球菌與谷丙轉氨酶水平及谷草轉氨酶呈正相關，雙歧桿菌、擬桿菌等也分別于部分肝功能指標正顯著相關性，提示腸道菌群紊亂與患者肝功能損傷程度有關，部分綜述性報道［12］也有類似結論。

部分研究［13］還提示腸道菌群失衡在CHB 肝硬化其它并發癥的發生及發展中起重要作用，并與患者預后情況有一定相關性。因此探討主要菌種對診斷肝功能嚴重下降的界值有一定價值。本研究所納入6 種細菌均能夠有效診斷Child-Pugh 分級B～C 級，這提示其積極檢測上述糞便中上述菌種水平，對早期預測患者預后有一定價值。本研究發現當腸桿菌數量≤6.05 單位、腸球菌數量≤5.09 單位、擬桿菌數量≥6.12 單位、梭菌屬≥6.91 單位、乳酸桿菌≥4.31 單位、雙歧桿菌≥5.72 單位時，患者肝功能多處于較良好水平，進一步提示在CHB 早期需要重視改善患者腸道菌群失衡，這與既往報道［14］結論相符。

本研究亦有一定不足：目前基于宏基組高通量全基因組測序技術檢查腸道菌群，可檢測到門、綱、目、科、屬、種水平，腸道在屬種水平有300 余種菌［15］，本研究只檢測了6 種常見，存在明顯偏差，尚待后續研究補充。

總之，CHB 患者普遍存在腸道菌群失調，表現為腸桿菌屬、腸球菌屬數量上升，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數量下降，且變化程度與肝功能有密切關系。