大鼠閉合性胸外傷所致肺挫傷模型構建

汪雷 付靜怡 吳偉銘 郭翔 楊異

肺挫傷是胸部閉合性外傷后常見疾病，屬于肺損傷，部分較嚴重的肺挫傷易進展為肺部感染、肺不張及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，可直接導致患者死亡或遺留永久性的肺功能殘障[1-2]，嚴重影響生活質量，增加社會負擔。隨著我國經濟的發展，交通日益發達、基礎建設日益增多，此類疾病發生率在相當長時間將保持增長趨勢。目前，臨床上針對胸外傷所致肺挫傷的治療措施主要以對癥處理為主，對重癥患者的療效有限，究其原因，是對于此類疾病的發病及進展機制尚不清楚。良好實用的動物模型可以較好地模擬類似傷情，為進一步開展相關研究提供良好的平臺。截至目前，文獻報道的相關模型均存在不同程度的不足，如大動物犬、羊及豬動物模型花費高、穩定性較差[3-5]，小動物造模器材較為復雜、難以復制等，限制了模型的應用[6-7]。本研究旨在建立一種簡便實用、可推廣的大鼠閉合性胸外傷所致肺挫傷模型。

材料與方法

一、造模裝置的制作及原理

一根垂直中空PVC管道（管徑稍大于砝碼最大直徑，長度、管徑可按實驗要求選擇），由連接裝置固定于木質小動物解剖臺（用于固定實驗動物），撞擊器材為不同質量的制式砝碼（圖1）。工作原理是通過砝碼從一定高度自由落體，以一定能量撞擊實驗動物右胸，造成其肺挫傷?？諝饽Σ亮雎圆挥?，打擊能量的計算根據公式E=mgh（g=9.8 m/s2）。參照前期預實驗結果，選擇砝碼質量為200 g，100 g，自由落體高度為60 cm和100 cm。

圖1 造模裝置（木質小動物解剖臺通過連接裝置固定PVC管道）

二、動物分組及實驗方法

選取SD雄性大鼠40只，體重220～240 g，由上海市第六人民醫院動物實驗室提供。根據造模能量的不同，參考以往文獻，結合預實驗結果，按隨機數字表法隨機分為A組（對照組，撞擊能量0 J）、B組（100 g，60 cm，撞擊能量0.588 J）、C組（100 g，100 cm，撞擊能量0.98 J）、D組（200 g，60 cm，撞擊能量1.176 J）、E組（200 g，100 cm，撞擊能量1.96 J），每組8只。具體實驗過程：大鼠造模前12 h禁食禁水。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉滿意后（3%戊巴比妥鈉，1:5稀釋，每100 g體重注射1 mL），大鼠仰臥位，右上肢外展，固定后，暴露右側胸壁，局部剃毛，將不同質量制式砝碼從不同高度自PVC管道垂直自由落體（管道作用是保持砝碼垂直自由落體，管壁不與砝碼接觸），打擊點為SD大鼠右側第4肋間范圍。

三、肺挫傷程度的評估

1.影像學評估：通過CT計算肺挫傷比值。存活大鼠在造模24 h后送至小動物CT平臺（SkyScan 1176，Bruker MicroCT，Kontich，Belgium）行薄層CT掃描，層厚35 μm。掃描后利用體積計算程序，在橫斷面圖像上，定位挫傷區域后，從上至下逐個層面描記挫傷肺組織的輪廓，系統體積計算程序自動生成該側挫傷肺組織體積的絕對值。同樣方法逐個層面描記、生成該側總肺組織體積絕對值。計算得出肺挫傷比值=（肺挫傷體積之和/肺體積之和）×100%。

2.病理學評估：造模后24 h，完成CT檢查后處死動物，選取肺挫傷部位，予組織固定液固定（10%中性緩沖甲醛固定液），切片后HE染色，鏡下觀察肺挫傷程度。

四、統計學分析

數據處理應用SPSS20.0軟件。計量資料采用±s表示，多組間對比采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組實驗動物大體情況及病死率

A組、B組、C組、D組無死亡，E組死亡3只，均在造模后出現呼吸動作異常，30 min內死亡，E組病死率37.5%，解剖發現均為右側多根多處肋骨骨折、胸廓軟化，胸腔可見大量血塊。

二、影像學檢查結果

胸部CT提示：A組、B組大鼠無明顯骨折，C組、D組各有單根和兩根骨折1例，A組、B組、C組及D組無明顯血氣胸。E組存活大鼠有3只發生2根肋骨骨折，1只發生3根肋骨骨折，另一只發生3根以上肋骨骨折（合并少量血胸）。各組肺挫傷比值見表1。統計學分析提示4組間肺挫傷體積占正常肺組織體積的百分比差異有統計學意義（P＜0.05）。肺挫傷的不同CT表現見圖2，其中以局部云絮樣改變更為多見。

圖2 肺挫傷CT表現：局部可見云絮樣改變（A），局部肺實變（B）

表1 各組肺挫傷比值

三、病理檢查結果

HE染色提示肺挫傷組織發生不同病理改變，A組大鼠肺部無挫傷。大鼠肺部挫傷表現為肺泡內淤血（圖3A），或肺泡內淤血，局部炎性細胞浸潤（圖3B），也可表現為大量炎性細胞浸潤，肺泡間隙異常增大（圖3C），以前兩種表現為主。大鼠心臟切片HE染色提示，心肌組織無明顯損傷（圖4）。

圖3 肺挫傷鏡下病理表現（HE，×100）：少許肺泡內淤血（A），或較多肺泡內可見淤血，局部炎性細胞浸潤（B），也可表現為大量炎性細胞浸潤，肺泡間隙異常增大（C）

圖4 心肌細胞無明顯損傷（HE，×100）

討 論

肺挫傷是閉合性胸外傷較常見的并發癥，部分輕癥患者可自愈，部分較重患者如不及時處理，可進展為肺部嚴重并發癥甚至ARDS。肺挫傷是胸外傷預后不佳的主要危險因素之一[8]，雖然本質上也屬于急性肺損傷，但由外傷性肺挫傷、全身感染或其他原因所致的ARDS病死率并不相同[9]，提示不同致病因素肺挫傷發生進展機制可能并不完全一致。截至目前，肺挫傷的具體發生機制的理論研究和有效治療方法的臨床實踐均無突破，因此構建合適的動物模型尤為重要。

目前已有的肺挫傷模型中，大動物模型有犬、羊、豬，雖然這些模型部分模仿了人類受傷，但體型大，制作需要較高的人力及較多的經費，且缺乏分子探針、其他細胞和介質特異性試劑，限制了進一步使用；有學者構建了嚙齒類動物模型，但造模的器材較為復雜，大多需要專門的設備，如特制保護罩、專用撞擊裝置等[10-11]，重復此類實驗必須有相應特制器材，這進一步增大了建模難度，增加了成本。本研究的造模裝置用材常見，安裝簡單，利于推廣，尤其適合基層單位開展研究。既往研究均已建立雙側肺挫傷模型和單側肺挫傷模型，但本中心在臨床工作中發現，近年來，隨著致傷原因的改變，單側肺挫傷較雙側肺挫傷更多見，因此更貼近臨床。本研究構建了單側損傷模型。此外，單側損傷模型避開撞擊左胸，更有利于避免心臟損傷，一定程度上減少了后續研究的干擾因素。

建模動物肺挫傷的程度是建模的關鍵指標之一。如肺挫傷過于嚴重，模型動物可能近期死亡，或干預效果不能體現，肺挫傷程度較輕，動物?？焖僮孕行迯?，目前動物模型的肺挫傷具體程度尚無統一意見，本研究認為應將肺挫傷程度控制適中。目前認為CT是評估肺挫傷程度敏感度最高的檢查[12]。有研究證實，肺挫傷體積占總肺體積28%以上是繼發ARDS等嚴重肺部并發癥的臨界預測指標[13]。結合預實驗發現肺挫傷占比超過40%以上的大鼠較易發生死亡，肺挫傷占比20%以下的大鼠大多很快恢復，設定20%～40%作為建模的肺挫傷具體標準。本研究建立的1.176 J能量模型組，全組大鼠無死亡，造模后24 h胸部CT檢查提示肺挫傷體積（32.74±4.14）%，數據差異相對較小，可重復性強，達到了預期目標。

本組實驗造模出現肋骨骨折相對較少，主要原因是制式砝碼底部較寬，打擊接觸面積相對較大，局部壓強不至于過分集中，一定程度上減少了肋骨骨折發生。此外，心肌病理檢查顯示心肌無明顯損傷。提示撞擊重物選擇和撞擊范圍較為滿意。本研究撞擊的能量小于其他實驗，主要原因有2點：本組實驗構建的是單側肺挫傷模型，能量直接用于造模，有些研究撞擊的能量在特殊裝置中部分消耗；二是本組實驗動物由于小動物CT機掃描床規格所限，檢查動物體質量原則上不能選擇超過250 g，相較其他研究中動物質量較小。

本實驗緊貼臨床實際，裝置制作簡便，致傷原理單一，較好地模擬了閉合性胸外傷致傷環境，以打擊高度和撞擊物的質量作為變量，可以根據實際情況調節，實驗結果可重復性較高，為閉合性胸外傷肺挫傷的機制及治療研究提供了較好的動物模型，尤其適合基層單位開展相關研究。