B亞型禽偏肺病毒滅活疫苗對商品肉雞免疫效果的研究

包媛玲，何錫棟，于蒙蒙，劉 鵬，陶蓉蓉，肖美麗，王素艷，李欣翼，胡守平，劉愛晶，張艷萍，劉長軍，祁小樂，王笑梅,3，高玉龍*

（1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室禽免疫抑制病創新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2.福建圣澤生物科技發展有限公司，福建 南平 354100；3.揚州大學江蘇省動物重要疫病與人畜共患病協同創新中心，江蘇 揚州 225009）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）屬于副粘病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬，為單股不分節段的負鏈RNA 病毒[1]。自1978 年在南非首次分離到aMPV 以來，其在世界許多國家均有報道[2-3]。根據aMPV 基因組和抗原的不同，可將其分為A、B、C、D 4 個亞型[4-5]。

aMPV 的自然宿主為雞和火雞，在雉、鴨、珍珠雞、鴕鳥、海鷗、麻雀和其它野生遷徙鳥中也存在[6-7]。aMPV 可感染任何日齡的雞和火雞，是引起火雞鼻氣管炎和肉雞腫頭綜合征的主要病原體。雞和火雞感染aMPV 后主要表現為啰音、打噴嚏、流鼻涕，泡沫性結膜炎，眶下竇腫脹以及單側或雙側眶周和面部腫脹[8]。aMPV 單一感染時雞的死亡率不高，但易造成傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞支原體、大腸桿菌或其他病原體的繼發感染，導致病情加重，死亡率顯著升高[9]。因此，aMPV 對養禽業造成的危害不容忽視。

在我國，自沈瑞忠等于1999 年首次在黑龍江某肉種雞場分離到aMPV 以來，陸續有學者對aMPV 的流行情況進行了調查[10]。血清學調查結果顯示，多個地區雞場aMPV抗體的陽性率高達100.0%[11]。aMPV對雞的感染無品種差異性，父母代和商品代雞及多個品種的種雞均可感染aMPV。病原學調查結果顯示，我國雞群中存在A、B、C 3 種亞型aMPV 的感染。2016年，有研究人員采集江蘇、遼寧、河南、山東、河北等地區種雞的鼻甲骨和鼻粘液經RT-PCR 檢測，結果顯示，雞aMPV的陽性率為50.7%，其中蛋雞與肉種雞aMPV 的陽性率分別為7.5%和88%。隨機對9 個陽性樣品G基因序列的分析結果顯示，這些樣品均為B亞型aMPV（aMPV/B），表明aMPV/B 在我國廣泛流行[12]。目前，國外已研制出aMPV 疫苗并在養殖場普遍應用，而我國目前并無批準使用的aMPV疫苗。

本研究團隊前期以從我國雞中分離的aMPV/B LN16 株為種毒[13]，研制出對SPF 雞具有良好免疫保護效果的aMPV/B 滅活疫苗[14]。為評估該疫苗在商品肉雞中的應用前景，本研究系統評價了aMPV/B 滅活疫苗對商品肉雞的免疫保護效果，為肉雞養殖場禽偏肺病毒病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料aMPV/B 滅活疫苗由本實驗室制備并保存。Vero 細胞由本實驗室保存。aMPV/B LN16 株由本實驗室分離、鑒定并保存[12]。1 日齡肉雞由福建圣澤生物科技發展有限公司提供。TRIzol試 劑、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture、TaqTMHot Start 均購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉錄試劑盒HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR 購自南京諾唯贊有限公司；aMPV ELISA 抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司。

1.2 實驗設計選取3 周齡商品肉雞，隨機分成兩組：免疫組（n=10）和陰性對照組（n=10），飼養于負壓隔離器中。免疫組雞采用胸肌注射的方式接種0.5 mL滅活疫苗，陰性對照組雞經胸肌注射0.5 mL 無菌PBS。首免后3 周加強免疫一次（n=10）。加強免疫后3 周以aMPV/B LN16 株攻毒（5 000 TCID50/只，滴鼻200 μL），然后進行后續試驗。

1.3 攻毒后各組雞臨床癥狀觀察及保護率的統計攻毒后1 d～7 d 觀察各組雞的臨床癥狀，并根據公式計算免疫保護率：疫苗保護率=（對照組發病率-接種組發病率）/對照組發病率×100%。

1.4 各組雞血清抗體水平的ELISA檢測首免后1周～6 周采血，分離血清并1∶500 稀釋后，利用aMPV ELISA 抗體檢測試劑盒檢測各組雞免疫后不同時間（首免后1 周～6 周）血清的抗體水平。

1.5 各組雞血清中和抗體效價的測定將1.4 中分離的各組雞血清樣品于56 ℃滅活30 min，0.45 μm 濾器過濾，2 倍倍比稀釋（22～28）后，與aMPV LN16 株（4 000 TCID50/mL）等體積混合，于37 ℃孵育1 h。將100 μL的混合物加入96 孔板中的Vero 細胞中，每個樣品做6 個重復，置37 ℃孵育1 h，更換為1%血清的DMEM 培養基。繼續培養并觀察細胞病變效應（CPE），連續記錄7 d。使用Reed-Muench 方法計算血清中和抗體的效價。

1.6 各組雞排毒的熒光定量PCR（qPCR）檢測采集1.2 中各組雞攻毒后1 d～7 d 的鼻拭子，溶于600 μL PBS 中，渦旋振蕩混勻后300 ×g 離心5 min，取上清（200 μL）用TRIzol 試劑提取總RNA，反轉錄為cDNA后作為模板，采用文獻[13]中aMPV/B 的qPCR 方法分別檢測各組雞的排毒情況。

1.7 各組雞各臟器組織病理學變化的觀察攻毒后9 d 剖殺各組雞，分別取其鼻甲、氣管和肺臟組織樣品于10%福爾馬林中固定，脫水后常規包埋，制作石蠟切片，HE 染色后經顯微鏡觀察各組雞各臟器組織的病變情況。

1.8 數據的統計與分析采用GraphPad 軟件8.0.2進行數據統計分析，采用雙向方差分析各組間的差異性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組雞攻毒后臨床癥狀的觀察及保護率的統計結果aMPV/B 滅活疫苗加強免疫后3 周，以aMPV/B LN16 株攻毒，攻毒后1 d～7 d 觀察各組商品肉雞的臨床癥狀。結果可見，攻毒后第3 d 開始，對照組雞出現臨床癥狀，主要表現為有混濁或粘稠泡沫樣、牽絲狀鼻液，個別雞有鼻痂等，至攻毒后7 d，其臨床癥狀完全消失。免疫組僅有一只雞出現積壓有鼻液的癥狀。對照組雞發病率為90.0%，免疫組雞的發病率為10.0%，經計算，免疫保護率為88.9%。表明該aMPV/B 滅活疫苗能夠有效保護商品肉雞免受B 亞型aMPV 強毒的攻擊。

2.2 各組雞血清抗體水平的ELISA 檢測結果商品肉雞免疫aMPV/B 滅活疫苗后，于首免后不同時間采用ELISA 檢測各組雞血清的抗體水平。結果顯示，首免后1 周～6 周，免疫組商品肉雞血清抗體水平逐漸升高，首免后第2 周其血清抗體陽性率達100%，首免疫后3 周該組雞血清平均抗體效價為1∶11 846，加強免疫后3 周即首免后6 周該組雞血清平均抗體效價為1∶36 619。而陰性對照組雞血清抗體一直呈陰性（圖1）。上述結果表明，該aMPV/B 滅活疫苗能夠誘導商品肉雞產生較高水平的aMPV 特異性抗體，且加強免疫后誘導雞產生的抗體水平高于單次免疫。

圖1 aMPV/B滅活疫苗免疫后商品肉雞血清抗體水平的檢測結果Fig.1 Serum antibody levels of commercial broilers immunized with aMPV/B inactivated vaccine

2.3 各組雞血清中和抗體水平的檢測結果采用固定病毒稀釋血清的方法檢測各組雞血清中和抗體效價，結果顯示，免疫后2 周免疫組雞血清中和抗體的陽性率為30%，免疫后3 周該組雞血清中和抗體的陽性率達100%，首免后3 周和加強免疫后3 周（首免后6 周）血清平均中和抗體效價分別為4.7 log2 和6.5 log2（表1）。上述結果表明，該aMPV/B滅活疫苗能夠誘導商品肉雞產生較高水平的中和抗體。

表1 aMPV/B滅活疫苗免疫后商品肉雞血清中和抗體效價的檢測結果Table 1 Serum neutralizing antibody levels of commercial broilers immunized with aMPV/B inactivated vaccine

2.4 各組雞攻毒后排毒的RT-qPCR檢測結果aMPV/B滅活疫苗加強免疫后3 周，以aMPV/B LN16 株攻毒，并采用RT-qPCR的方法檢測攻毒后不同時間各組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數。結果顯示，免疫組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數為2 792 拷貝/200 μL～45 980 拷貝/200 μL；對照組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數為8 133拷貝/200 μL～238 297拷貝/200 μL，前者較后者降低了64.6%～80.7%。各組雞在攻毒后7 d的鼻拭子中均未檢測到該病毒，且均在攻毒后3 d 兩組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數均最高（圖2）。結果表明，該aMPV/B滅活疫苗可以顯著降低aMPV/B 強毒攻擊后商品肉雞的排毒水平。

圖2 各組雞攻毒后排毒的RT-qPCR檢測結果Fig.2 Virus shedding of commercial broilers after virulent aMPV/B challenge

2.5 各組雞攻毒后各組織病理學變化的觀察以aMPV/B LN16 株攻毒9 d 后剖殺各組雞，取其各組織制作病理切片。觀察結果可見，陰性對照組雞鼻甲的鼻黏膜固有層有大量炎性細胞浸潤；氣管粘膜固有層內有少量炎性細胞浸潤；肺房壁可見炎性細胞浸潤（黑色箭頭所指）。而免疫組雞各組織均未見明顯病理變化（圖3）。上述結果表明，該aMPV/B 滅活疫苗能夠有效預防aMPV/B 強毒攻擊后商品肉雞呼吸器官的病理反應。

圖3 各組雞攻毒后的鼻甲、氣管及肺臟病理變化的觀察Fig.3 Histopathologic changes of the turbinate trachea and lung of commercial broilers after aMPV/B challenge

3 討 論

aMPV 在我國雞中普遍流行，感染雞表現出呼吸道癥狀以及眼眶周圍竇和眶下竇腫，斜頸等。研究表明，我國肉種雞和商品代雞aMPV 抗體的陽性率均較高，且抗體效價及抗體陽性率隨著雞日齡的增長而逐漸升高[11,15]。病原學檢測結果顯示，肉雞中以aMPV/B 為主[12-13]。本研究室前期研制了aMPV/B 滅活疫苗，并證實其對SPF 雞的免疫保護效果良好[14]。本研究進一步評估了該滅活疫苗對商品肉雞的免疫保護效果，為該滅活疫苗在商品肉雞養殖場的應用提供參考。

aMPV 主要存在于雞的鼻甲、氣管、喉頭等上呼吸道中，主要通過直接或間接接觸在雞群內水平傳播[16]。隨著雞體內抗體水平的變化，可能出現aMPV的反復感染。本研究中，與陰性對照組雞相比，免疫組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數顯著降低，這可能與滅活疫苗刺激機體產生的中和抗體有關，中和抗體可以與病毒顆粒結合從而阻止其進入宿主細胞。另外，本研究在免疫雞血清中還檢測到較高水平的ELESA 抗體。由此表明，該滅活疫苗免疫后可以刺激機體產生較強的體液免疫反應，從而降低排毒，減輕病毒在雞群內水平傳播的風險。

已有研究表明，aMPV 感染雞后所致疾病的嚴重程度和死亡率在很大程度上受繼發性細菌感染的影響，aMPV 單一感染時，雞的死亡率不高，若有混合感染，其死亡率可高達25%～40%[17]。本研究雞的免疫攻毒結果顯示，免疫組雞的呼吸道（鼻甲、氣管）黏膜均未見明顯的病理變化，上呼吸道黏膜的完整性能夠確保機體的第一道防線不被破壞，因而滅活疫苗阻斷了aMPV 及其他病原體的侵入，降低了繼發感染的可能性。

本研究采用的免疫程序為3 周齡首免，6 周齡加強免疫，血清抗體檢測結果顯示，單次免疫后3 周及加強免疫后3 周，免疫組雞平均抗體效價分別為1∶11846 和1∶36619。與以往制備的aMPV疫苗免疫雞后未能檢測到中和抗體不同[18]，本研究研制的aMPV/B 疫苗單次免疫后3 周及加強免疫后3 周，誘導雞產生的平均中和抗體效價分別為4.7 log2 和6.5 log2。血清特異性抗體及中和抗體作為保護性免疫反應的關鍵因子，能夠用于評估疫苗所誘導的免疫應答水平。這些結果表明，該滅活疫苗刺激機體產生了強烈的體液免疫應答，且加強免疫的效果優于單次免疫。

疫苗接種是防控aMPV 傳播與流行的重要手段。本研究結果表明aMPV/B 滅活疫苗對商品肉雞的免疫保護效果良好，加強免疫的保護效果優于單次免疫，這些結果為肉雞養殖場中的aMPV/B 感染的防控和其滅活疫苗免疫程序的制定提供了參考。