旋毛蟲p53重組蛋白對血管內皮細胞通透性影響的研究

刁子洋，郭 琨，王姍姍，王雪瑩，侯嘉茗，薄祿琪，王 爽，宋銘忻

（東北農業大學動物源性人獸共患病黑龍江省重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

旋毛蟲?。═richinosis）是由旋毛蟲（Trichinella spi?ralis）感染引起的一種重要的呈世界性分布的人畜共患線蟲病，對人類健康和畜牧業危害嚴重，也是一種重要的食源性人獸共患寄生蟲病[1]。解剖發現，旋毛蟲感染在空腸引起黏膜充血、水腫、灶性出血的癥狀。并且在急性發作時，多有眼瞼與面部水腫，嚴重者下肢水腫[2]。水腫產生的原因之一是血管內皮細胞通透性的增加。

旋毛蟲排泄分泌抗原（ES 抗原）是由桿狀體分泌的一種復雜抗原成分，不同生長階段蟲種分泌的ES抗原成分不同。其中，肌幼蟲分泌的ES 抗原中，43 ku、45 ku 和53 ku 抗原占全部ES 抗原含量的一半以上[3]，說明p53 糖蛋白抗原是ES 抗原的主要成分。研究表明，旋毛蟲ES抗原中49 ku、43 ku、53 ku混合蛋白中含有TLR4 的配體成分[4]，推測混合蛋白作用原理與同樣含有TLR4 配體的細菌脂多糖（LPS）相似。研究表明，LPS可作用于血管造成血管損傷[5]，推測這些蛋白中有造成血管損傷的成分。

內皮細胞屏障是維持血管通透性的重要因素[6]。血管內皮細胞間的黏附連接和血管內皮細胞結構完整是構成血管內皮屏障的兩個因素[7]。血管內皮細胞通透性升高是由內皮細胞連接蛋白表達異常和血管內皮細胞發生損傷導致[8]。推測線粒體凋亡通路可能導致血管內皮細胞發生凋亡，引起血管通透性增加。內皮細胞連接蛋白包括ZO-1、VE-cadherin等，通過檢測這兩種連接蛋白，可以觀察細胞間連接的變化。

本研究以人臍靜脈內皮細胞（HUVES）作為細胞模型，通過旋毛蟲p53 重組蛋白（Ts-p53）體外刺激HUVES，檢測內皮細胞通透性，分析線粒體細胞凋亡通路中相關凋亡蛋白與抗凋亡蛋白及緊密連接蛋白和粘附連接蛋白含量的變化，研究旋毛蟲致宿主出現水腫的機制，解析旋毛蟲感染與宿主血管通透性之間的關系，這對研究旋毛蟲感染的發病機制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 蟲種、細胞系及蛋白旋毛蟲分離自黑龍江遜克豬，由本教研室保存；HUVES 細胞由內蒙古大學生命科學學院生化與分子生物學教研室惠贈；Tsp53 重組蛋白由本實驗室表達并保存。

1.2 主要試劑LPS 購自北京博奧拓達科技有限公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒和FITC-BSA 購自大連美侖生物公司；6 孔Transwell 小室購自杭州沃森生物技術有限公司；SYBR Premix ExTaqⅡ購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗GAPDH、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗間連蛋白Cytochrome C、兔抗Pro-Caspase-9、兔抗cl-Caspase-9、兔抗Pro-Caspase-3、兔抗cl-Caspase-3、兔抗VE-cadherin 和Zo-1 多抗及山羊抗兔IgG-HRP 均購自中國Abmart 公司。

1.3 細胞培養及分組HUVES 用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，每2 d～3 d 傳代一次。實驗分為3 組：（1）空白對照組：正常培養細胞18 h；（2）實驗組：HUVES細胞與Ts-p53蛋白共培養，分別培養3 h、6 h、12 h 和18 h；（3）陽性對照組：HUVES 細胞與1 μg/mL 的LPS 共培養18 h。

1.4 Ts-p53 刺激HUVES 細胞的濃度優化將對數生長期的HUVES 細胞鋪于96 孔板中，每孔1×105個細胞，每5個孔為一組。待細胞長滿單層后，分別加入10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL 的Ts-p53 培養12 h，陽性對照組為用LPS 刺激的細胞，空白對照組為不做處理的空白組細胞。12 h 后棄上清，重新加入培養基，并按每孔培養基總體積的10%加入CCK-8 溶液，孵育4 h，經酶標儀檢測OD450nm值，按CCK-8 試劑盒說明書計算細胞的存活率，以上試驗重復3 次。

1.5 Ts-p53 對內皮細胞通透性的影響將處于對數生長期的HUVES 鋪于Transwell 上層小室，待細胞鋪滿上層后，換成含2%胎牛血清的DMEM 培養液培養2 h。以1.4 確定的最適濃度Ts-p53 按照1.3 的分組處理細胞。在上層中加入FITC-BSA，下層加入含10%胎牛血清的培養基，繼續培養1 h 后，分別吸取每孔上下層培養液各100 μL，測定各組OD520nm值。單層內皮細胞的通透系數（Pa 值）=各組OD520nm值/陽性對照組OD520nm值。以上試驗重復3 次。

1.6 Ts-p53 刺激HUVES 對Bax、Bcl-2 轉錄 及表達水平影響的檢測根據GenBank 中登錄的相關基因序列設計引物，Bax 和Bcl-2 引物序列如表1。利用1.4 最適濃度Ts-p53 刺激HUVES 并按照1.3 分組，于刺激后不同時間（3 h、6 h、12 h、18 h）收獲各組細胞，提取各組細胞的總RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，利用qPCR 檢測Ts-p53 刺激HUVEC 對其線粒體凋亡通路中Bax 和Bcl-2 的影響。另外，按照1.4 的方法培養HUVEC，利用RIPA蛋白裂解液提取不同時間（3 h、6 h、12 h、18 h）各組細胞可溶性粗蛋白，再經BCA 蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，并調整濃度統一后制備成蛋白樣品，分別以兔抗Bax 和兔抗Bcl-2（1∶500）為一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶4 000）為二抗，采用ECL 發光液顯影后，通過western blot 檢測Ts-p53 刺激HUVEC 對其線粒體凋亡通路中Bax 和Bcl-2 的影響。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences of qPCR

1.7 Ts-p53 刺激HUVES 對凋亡通路中相關蛋白表達水平的影響 為了檢測Ts-p53 刺激HUVEC 對線粒體凋亡通路中細胞凋亡關鍵因子Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3、cl-Caspase-3 蛋白表達量的影響，按照1.3 的方法分組及利用1.6 中所述western blot 方法進行檢測。

1.8 Ts-p53 刺激HUVES 對ZO-1 及VE-cadherin轉錄及表達水平影響的檢測為了檢測Ts-p53 刺激HUVEC 對內皮細胞間連接蛋白ZO-1 及VE-cadherin轉錄水平及蛋白表達的影響，按照1.3 的分組及利用1.6 中所述qPCR 方法和western blot 方法檢測。

1.9 統計學分析利用SPSS 20.0 軟件對數據統計分析，Graphpad Prism 7.0 軟件對數據作圖，所有數值以平均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）法，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；采用2-ΔΔCt方法分析結果，計算各基因轉錄水平的相對變化；利用Image-J 軟件對western blot 結果經進行灰度值分析，目的蛋白的相對含量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

2 結 果

2.1 Ts-p53 刺激HUVES 細胞的濃度優化結果將HUVES 與不同濃度的Ts-p53 共培養12 h，采用CCK-8 方法檢測每組細胞的存活率。結果顯示，與空白 對 照 組 相 比，當Ts-p53 濃 度 為0～20 μg/mL 時，HUVES的存活率均較高，差異不顯著（P＞0.05）；當Tsp53濃度大于30 μg/mL 時，HUVES 的存活率呈濃度依賴性顯著降低（P＜0.01）；當Ts-p53 濃度為60 μg/mL時，HUVES存活率約為60%。陽性對照組中HUVES的存活率約為50%，存活率顯著降低（P＜0.01）（圖1）。綜上，本實驗選用濃度為60 μg/mL Ts-p53用于后續試驗。

圖1 Ts-p53刺激HUVES細胞濃度優化的結果Fig.1 Optimization of HUVES cell concentration stimulated by Ts-p53

2.2 Ts-p53對內皮細胞通透性影響的檢測結果利用60 μg/mL Ts-p53刺激HUVES 3 h、6 h、12 h、18 h后，分別測定Transwell 小室上下層培養液的OD520nm值。隨著刺激時間的延長，Pa 值呈上升趨勢。與空白對照組相比，在Ts-p53 刺激HUVES 3 h 和6 h 時，Pa值增大，差異極顯著（P＜0.01）；在刺激12 h 時，Pa值最高，為空白對照組的1.6倍（P＜0.01）；在刺激18 h時，Pa 值開始下降（P＜0.01）。陽性對照組LPS 刺激HUVES 12 h時，Pa值約為空白對照組的1.9倍（圖2）。結果表明Ts-p53 可以誘導HUVES 的通透性增加導致內皮屏障功能改變。

圖2 Ts-p53對HUVES通透性影響的檢測結果Fig.2 Effect of Ts-p53 protein on permeability of HUVES

2.3 Ts-p53 對Bax、Bcl-2 轉錄及表達水平的影響的檢測結果通過qPCR 和western blot 方法檢測Tsp53 刺激HUVES 對Bax、Bcl-2 轉錄及表達的影響。qPCR 結果顯示，與空白對照組相比，刺激3 h、6 h時，Bax的轉錄水平呈時間依賴性增加，直到刺激12 h時達到峰值，刺激18 h時轉錄水平開始下降，且各組Bax轉錄水平均低于陽性對照組，差異極顯著（P＜0.01）（圖3A）。與空白對照組相比，Bcl-2 的轉錄水平呈時間依賴性降低，在刺激3 h、6 h 時，轉錄水平持續下降，在刺激12 h 時轉錄水平最低，刺激18 h時轉錄水平升高，且陽性對照LPS組Bcl-2的轉錄水平極顯著低于其他組（P＜0.01）（圖3B）。與空白對照組相比，Bax/Bcl-2 的比值在刺激3 h、6 h 和12 h 時呈時間依賴性下降，刺激12 h 時比值最低，刺激18 h 時上升，陽性對照組的該比值最高（P＜0.01）（圖3C）。Western blot 結果顯示，與空白對照組相比，刺激3 h、6 h 時，Bax 蛋白表達量極顯著增加（P＜0.01），直到12 h 達到峰值，表達量約為空白對照組的2.4倍，在刺激18 h時表達量減少，陽性對照組的表達量則極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖3E）。Bcl-2的蛋白表達量呈下降趨勢，在刺激3 h、6 h、12 h 時表達量逐漸降低，刺激12 h 時表達量最低，刺激18 h時表達量增加，陽性對照組Bcl-2 的表達量極顯著低于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖3F）。綜上表明，Ts-p53 蛋白刺激HUVES 后可激活該細胞線粒體中凋亡相關基因Bax和Bcl-2的轉錄和表達。

圖3 Ts-p53對Bax和Bcl-2的轉錄及蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of Ts-p53 on transcription and protein expression of Bax and Bcl-2

2.4 Ts-p53 對凋亡通路凋亡相關蛋白表達水平的影響的檢測結果利用western blot 方法檢測Ts-p53刺 激HUVES 對Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3 及cl-Caspase-3 蛋白表達水平的影響。與空白對照組相比，Cytochrome C 表達量從刺激3 h 起開始增多，直到刺激12 h 時達到峰值（P＜0.01），且約為空白對照組的2.2 倍，在刺激18 h時表達量下降，陽性對照組Cytochrome C 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖4B）。與空白對照組相比，Pro-Caspase-9的表達量在刺激3 h、6 h和12 h 均極顯著降低（P＜0.01），在12 h 時達到峰值，18 h 時表達量增加，陽性對照組Pro-Caspase-9表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）。而cl-Caspase-9 的表達量則與之相反，在3 h、6 h 和12 h 表達量逐漸增加（P＜0.01），12 h表達量達到空白對照組的1.8 倍，在18 h 表達量下降，陽性對照組cl-Caspase-9 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖4D）。與空白對照組相比，Pro-Caspase-3的表達量從3 h起開始下降，在12 h時最低（P＜0.01），18 h表達量開始增多，陽性對照組Pro-Caspase-3 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖4E）。而cl-Caspase-3 的表達量在刺激3 h、6 h、12 h時均增加，12 h 表達量最高（P＜0.01），18 h 表達量開始下降，陽性對照組cl-Caspase-3 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖4F）。表明，Ts-p53刺激HUVES，導致Cytochrome C 的表達量增加，Pro-Cas?pase-9與Pro-Caspase-3轉化為cl-Caspase-9和cl-Cas?pase-3，激活了線粒體凋亡通路從而誘導細胞凋亡。

圖4 Ts-p53對HUVEC線粒體凋亡相關蛋白表達影響的檢測結果Fig.4 Effect of Ts-p53 on the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins

2.5 Ts-p53 對ZO-1 及VE-cadherin 轉 錄及 表 達 水平影響的檢測結果為了驗證Ts-p53 誘導HUVES 細胞通透性增加與內皮細胞間連接蛋白表達異常有關，本研究利用qPCR 及western blot 方法檢測ZO-1 及VEcadherin 的轉錄及表達水平。qPCR 結果表顯示，與空白對照組相比，Ts-p53刺激3 h和6 h時，VE-cadherin的轉錄水平極顯著下降（P＜0.01），在刺激12 h 時轉錄水平最低，在刺激18 h時轉錄水平增高，陽性對照組中VE-cadherin 轉錄水平極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖5A）。與空白對照組相比，在刺激3 h和6 h 時，ZO-1 的轉錄水平極顯著下降（P＜0.01），在刺激12 h時轉錄水平最低，在刺激18 h時轉錄水平增加，陽性對照組中ZO-1轉錄水平極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖5B）。Western blot 結果顯示，與空白對照組相比，在刺激3 h 和6 h 時，VE-cad?herin的表達量極顯著下降（P＜0.01），在刺激12 h時表達量最少，在刺激18 h時表達量增加，陽性對照組中VEcadherin 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖5D）。與空白對照組相比，在刺激3 h和6 h時，ZO-1的表達量極顯著下降（P＜0.01），在刺激12 h時表達量最少，刺激18 h時表達量增多，陽性對照組中ZO-1 表達量極顯著高于空白對照組和實驗組（P＜0.01）（圖5E）。表明Ts-p53 可以引起內皮細胞間連接蛋白的損傷，導致HUVES 細胞的通透性的增加。

圖5 Ts-p53對Zo-1和VE-cadherin轉錄及蛋白表達水平影響的檢測結果Fig.5 Effect of Ts-p53 on transcription and protein expression of Zo-1 and VE-cadherin

3 討 論

感染旋毛蟲后，宿主眼瞼、面部、四肢等組織出現水腫，這是血管通透性增高的癥狀。表明感染旋毛蟲會破壞血管內皮細胞屏障，引起血管通透性增高。Ts-p53 是旋毛蟲ES 抗原的主要成分之一[9]。研究表明，旋毛蟲ES 抗原中43 ku、49 ku、53 ku 混合蛋白中含有TLR4 的配體成分[4]，推測混合蛋白作用原理與同樣含有TLR4 配體的細菌LPS 相似。p53蛋白屬于泰威糖[10]，泰威糖是LPS 的一類，LPS 可引起血管內皮細胞通透性的升高[5]。由此推測，Ts-p53與LPS 的作用原理相似，即可以引起血管內皮細胞通透性升高。本實驗利用Transwell 細胞滲透性實驗證實，Ts-p53 會呈時間依賴性引起HUVES 通透性增高，導致血管內皮屏障破壞。

血管內皮屏障是維持跨內皮細胞蛋白濃度、維持組織液生成與回流的重要結構。目前的研究認為，血管內皮細胞的損傷和內皮細胞間連接蛋白表達的異常是影響血管內皮細胞通透性的兩個重要因素[11]。血管內皮細胞結構和功能的穩定，是維持血管通透性的基礎。研究表明，失血性休克引起細胞凋亡介質增加，然后啟動內皮細胞凋亡和血管通透性增加[12]。細胞凋亡可以通過細胞內源途徑的線粒體凋亡通路引起，也可以由細胞外源途徑的“死亡配體”通路引起。凋亡發生時，促細胞凋亡（如Bak、Bax）基因和抗細胞凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xL）的平衡發生改變。Bcl-2 家族蛋白可以控制線粒體膜的通透性，進而控制線粒體凋亡調節分子的釋放[13]。Bcl-2 位于線粒體外膜的表面，調控線粒體膜的功能。Bax 位于細胞質基質中，在受到凋亡刺激后，附著在線粒體膜上的調節細胞凋亡。在本實驗中，HUVES 受到Ts-p53刺激后，Bax 表達量增多，Bcl-2 表達量減少，Bax/Bcl-2 值升高，并具有時間依賴性。說明Ts-p53 的刺激破壞了HUVES 細胞中Bax 與Bcl-2 的平衡，引起了細胞凋亡。Bax/Bcl-2 的增加可以導致線粒體功能障礙，線粒體膜電位發生變化，Cytochrome C 通過膜電位轉變孔轉運至細胞質中，促使細胞發生凋亡并刺激Caspase 蛋白聯級反應的發生。Caspase 蛋白是一系列在細胞凋亡過程中起重要作用的半胱氨酸蛋白酶，Caspase-3 和Caspase-9 蛋白裂解生成cl-cas?pase-3 和cl-caspase-9[14]。在內源性細胞凋亡途徑中，Cytochrome C 與Aparf-1 結合形成多聚體并與Caspase-9 結合形成凋亡小體，Caspase-9 被激活成活化的Caspase-9?；罨腃aspase-9 可以繼續激活效應Caspase，Caspase-3 作為效應因子被激活為活化的Caspase-3?；罨腃aspase-3 引起DNA 的復制和修復障礙，引起線粒體凋亡。在本實驗中，Cytochrome C的表達量增多，Caspase-3 和Caspase-9 均被活化?；罨腃aspase-3 是細胞凋亡的標志，可見Ts-p53 引起了線粒體途徑的細胞凋亡。

內皮細胞間連接是通過緊密連接（TJs）、黏附連接（AJs）兩個特定的結構調節血管通透性，同時也是內皮細胞通透性的重要結構基礎[15]。ZO-1 是TJs 的一種，屬于閉鎖帶蛋白（Zonula occludes，ZO）。ZO-1 是ZO 家族中研究最多的蛋白，廣泛表達于所有上皮和內皮細胞中。本研究中，在Ts-p53 的刺激下，ZO-1蛋白表達隨著時間的增加而減少，說明HUVES 的TJs已經遭到破壞。粘附連接蛋白（AJs）包括VE-cadherin等，抑制VE-cadherin的表達可使內皮細胞收縮并與內皮下基質暴露部分分離，破壞肺和心臟的血管內皮屏障[16]，說明VE-cadherin 是一種重要的細胞連接蛋白，對血管內皮屏障的維持起到重要作用。在本實驗中，VE-cadherin 的表達明顯下降，說明Ts-p53 會對AJs造成損傷。

綜上所述，本研究結果表明，Ts-p53 從引起HUVES 發生線粒體凋亡和減少內皮細胞間連接蛋白表達兩個方面破壞血管內皮屏障，降低了HUVES 通透性。這為進一步研究旋毛蟲導致機體水腫的發生提供理論依據。