野豬源豬圓環病毒4型的發現及其Cap基因序列分析

吳歡生，王飛兵，楊 艷，周光斌，陳 晨，徐田放，周貝怡，陳依婷，薛美佳，曹華斌*

（1.江西省畜禽疫病診斷與防控重點實驗室/江西農業大學 動物群發性疾病監測與防治研究所，江西 南昌 330045；2.江西省金溪縣農業農村局農業技術推廣中心，江西 撫州 344800；3.江西省農業技術推廣中心，江西 南昌 330096；4.江西省豐城市農業農村局，江西 豐城 331100；5.廈門海關技術中心，福建 廈門 361000）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，病毒粒子無囊膜，基因組為單股負鏈環狀DNA，是目前已知最小的動物病毒[1-2]。目前，已發現豬圓環病毒1 型（PCV1）[3]，豬圓環病毒2型（PCV2）[1]和豬圓環病毒3 型（PCV3）[4]。2019 年我國首次發現了一種新型PCV，命名為Porcine circovirus type 4（PCV4），隨后，國內多個研究團隊調查國內各省份（河南、山西、廣西、江蘇等）均存在PCV4 的流行[5-9]。PCV宿主范圍較廣，PCV1、PCV2最先在野豬中發現，于2018年證實PCV3可以感染野豬[10-11]，可見野豬在圓環病毒感染與傳播中起重要作用，那么PCV4能否感染野豬？基于此，本研究采集江西省多個山區野豬組織樣品，經PCR 方法檢測PCV4，同時擴增陽性樣品中的全長Cap 基因，并對其進行同源性及遺傳進化分析，為豐富PCV4 的流行病學資料提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 病毒株及樣品來源根據PCV4 全基因組序列HNU-AHZ-2019（MN162710）合成PCV4全基因組，并由北京擎科生物科技有限公司合成；25 份野豬組織樣品包含7 份淋巴組織、8 份腎臟組織、5 份脾臟組織、5 份大腸組織，采集自江西省不同山區，均來源于不同野豬，樣品保存于干冰中運送至江西省畜禽疫病診斷與防治重點實驗室-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑2×RapidTagMaster Mix 購自南京諾威贊生物科技有限公司；2×T5 Fast qPCR Mix、DL2000 DNA Marker 及病毒基因組DNA 提取試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；DNA 回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成參照GenBank 中PCV4 基因組序列HNU-AHZ-2019（MN162710）設計一對普通PCR 擴增引物Cap-F/Cap-R（表1），擴增Cap 全長基因；參照文獻[6]合成PCV4 特異性探針法qPCR 的探針（PCV4-P）和引物（PCV4F/PCV4R）（表1），引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司合成（長沙）。

1.4 樣品的qPCR 檢測及陽性樣品Cap 基因的PCR擴增取少許各組織樣品，加入少許無菌PBS，利用組織勻漿機充分打碎勻漿，反復凍融3 次充分釋放病毒，12 000 g 離心后，取上清，利用病毒基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA 作為模板，利用表1 中的引物，采用PCV4TaqMan qPCR 方法檢測，以無菌雙蒸水作為陰性對照，以合成的PCV4 基因組為陽性對照。擴增程序如下： 95 ℃30 s， 95 ℃5 s，共40個循環，60 ℃1 min收集熒光信號。根據上述結果選擇3 份陽性樣品和部分陰性樣品的DNA 經表1 中的引物采用常規PCR 擴增PCV4 Cap 基因，PCR 產物由北京擎科生物科技有限公司測序（長沙）。

表1 本研究所用的引物和探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.5 Cap 基因及氨基酸序列的同源性及遺傳進化分析采用DNAStar 軟件分析本研究獲得的野豬源PCV4 Cap 基因序列，并利用DNAStar 軟件分析這3 個Cap 基因與22 株圓環病毒Cap 基因的同源性。采用分子遺傳進化軟件MEG6 構建Cap 基因的進化樹并分析其遺傳進化關系。

2 結果與討論

2.1 野豬樣品PCV4 的qPCR 檢測結果PCV4Taq?Man qPCR 法的擴增結果顯示，陽性對照擴增出一條特異性S 型曲線，Ct 值為20.365，而陰性對照呈現一條水平直線，無Ct 值，表明該檢測方法有效。25 份野豬樣品的檢測結果顯示，其中有3 份樣品出現擴增曲線，分別為淋巴結、腎臟和脾臟樣品。Ct值分別為26.405、29.211、31.787，其余樣品均未出現擴增曲線（圖1），陽性率為12%（3/25），表明野豬中存在PCV4 的感染。目前，有關野豬感染豬源病毒的文獻較多，野豬可攜帶或感染多種病原，并造成傳播，如豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、PCV 包括PCV1、PCV2和PCV3 等[12-16]，本研究首次在野豬組織中檢測到PCV4，推測野豬可作為混合器攜帶并傳播多種PCV。

圖1 野豬樣品PCV4 的qPCR檢測結果Fig.1 The detection result of PCV4 from wild boars by qPCR assay

2.2 野豬陽性樣品PCV4 Cap 基因的PCR 擴增結果選取上述3 份陽性和8 份陰性樣品經常規PCR 擴增，結果顯示3份陽性樣品均擴增出約1 300 bp的目的條帶，其余陰性樣品均未擴增出該目的條帶（圖2），擴增片段位于PCV4 基因組464 nt～1 737 nt，覆蓋Cap全長基因。測序結果顯示，擴增片段均為PCV4 Cap全長基因，分別命名為JXNC-2020、JXYC-2020及JXGZ-2020，序列上傳NCBI 獲得登錄號分別為MW988110、MW988111、MW988112。本研究首次在野豬組織中擴增并獲得PCV4 Cap 基因序列。Zhang 等首次報道PCV4 為環狀基因組結構[9-11]，直接擴增PCV4 全長基因組較為困難，本研究經多種嘗試直接擴增PCV4 全長基因組均未成功，繼而選擇分段擴增。國內有多個研究團隊均是采用PCR 分段擴增方法擴增了家豬源的PCV4 全長基因組[12-16]，這可能與PCV4 基因組的特殊結構有關，本研究經PCR 擴增獲得了Cap全長基因，Cap蛋白為PCV4的衣殼蛋白，能夠誘導機體產生保護性抗體，Cap 全長基因的獲得為研究PCV4衣殼蛋白的多樣性奠定了基礎。

圖2 野豬組織樣品的PCV4 PCR擴增結果Fig.2 Traditional amplification of PCV4 in wild boars tissues samples

2.3 野豬源PCV4 Cap 基因的同源性分析 同源性分析結果顯示，3 個野豬源PCV4 Cap 基因序列之間的同源性為98.69%～100%，氨基酸序列的同源性為97.1%～100%。與GenBank 登錄的4 個家豬源PCV4 Cap基因序列的同源性為98.54%～99.13%，氨基酸序列的同源性為97.37%～99.12%，與其中韓國流行株E115 Cap 基因序列的同源性為98.11%～98.54%，氨基酸序列同源性為96.93%～98.25%。野豬源與國內家豬源PCV4 Cap 基因序列的同源性高于其與韓國流行株的同源性。表明野豬源PCV4 與國內家豬源PCV4 親緣關系更近，推測國內PCV4 可能在家豬與野豬間流行并傳播。氨基酸序列分析結果顯示，與韓國流行株E115 相比，JXNC-2020 和JXYC-2020 均存在3 個突變氨基酸，分別為R14W、N25S 和K69E；與韓國流行株E115 相比，JXGZ-2020 存在7 個突變氨基酸，分別為R14W、N25S、K69E、L100P、T110I、H137Y 及M211P；與國內家豬源PCV4 相比，野豬源PCV4 Cap 蛋白氨基酸序列的突變數少于其與韓國流行株相比。上述氨基酸突變可能會導致Cap 蛋白的抗原性發生變異。2019年我國首次在家豬檢出PCV4，隨后韓國也發現PCV4[17]。西班牙和意大利的300 多份野豬樣品的篩查結果顯示均無PCV4 陽性樣品[18]。我國野豬源PCV4與國內家豬源PCV4 Cap 基因序列同源性高于其與韓國流行株的同源性，表明，野豬可能參與了國內PCV4 的流行與傳播，也提示野豬可以充當活動載體傳播PCV4，且國內家豬、野豬可以互相傳播PCV4。

2.4 野豬源PCV4 Cap 基因的遺傳進化分析基于圓環病毒Cap 基因的進化樹結果顯示，22株圓環病毒形成兩大分支，野豬源PCV4 Cap基因與12株圓環病毒（包含家豬源PCV4、PCV1、PCV2及蝙蝠相關圓環病毒等）Cap 基因形成一大分支，且與4個家豬源PCV4 Cap基因處于一小分支；PCV3與其他9株圓環病毒（包含犬圓環病毒等）的Cap基因形成另一大分支（圖3），進一步表明野豬源PCV4 與家豬源PCV4 親緣關系較近。

圖3 基于Cap基因構建的圓環病毒遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on Cap gene of circovirus

野豬作為重要活動載體，參與了多種豬病病毒的傳播與擴散，目前已發現4 種PCV，其中PCV1/2/3均已報道可以感染野豬，本研究首次在野豬中發現PCV4，推測野豬可以作為混合器傳播多種PCV，為PCV的流行病學調查及其感染的防控帶來新挑戰。

總之，本研究首次發現我國野豬存在PCV4 的感染，豐富了PCV4 的自然宿主范圍，為進一步理解PCV4 跨物種傳播及其感染的防控提供科學依據。