傳統插片法接種方法的改進與應用

鄭菲菲 吳志新 李莉娟 黎潔 祝東梅

摘 要：放線菌的形態結構觀察是水產微生物學實驗課程的重要實驗之一，實驗教學中一直采用壓片浸染法和印片浸染法觀察放線菌的形態結構，但觀察效果不好。采用插片浸染法后，學生通過簡單操作即可清晰地觀察到完整自然的基內菌絲、氣生菌絲和分生孢子形態。傳統插片法接種操作不方便，接種時間長，效率低;改進后的接種方法不僅操作簡單方便省時，而且還大大提高了實驗教學的效果，激發了學生探索微觀世界的興趣。

關鍵詞：放線菌;插片法;接種;形態結構觀察

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）01-0138-02

水產微生物學實驗是水產養殖和水族科學與技術專業重要的專業基礎必修課。通過課程的學習，學生不僅可以強化和鞏固對微生物理論知識的理解和認知[1]，還可以掌握從事微生物學及生物學研究的基本方法和技術。放線菌的形態結構觀察是實驗課中重要的實驗內容，以前實驗教學一直采用壓片浸染法和印片浸染法來進行觀察，很難清晰地觀察到放線菌的形態和結構，遠遠無法達到預期的實驗教學效果。因此，亟需對實驗方法進行改進和創新。

探尋一種更簡單有效的方法非常必要。蔡信之[2]在1995年就提出采用插片法觀察放線菌的形態比印片法和涂片法效果更好，可以觀察到放線菌的基內菌絲（營養菌絲）、氣生菌絲和分生孢子的完整自然形態。汪紅等[3]又提出插片結合浸染法可以增加放線菌菌絲和孢子與背景的反差，從而提高放線菌形態觀察的效果并增加實驗的趣味性，并且插片浸染法憑借其優勢還在放線菌的篩選鑒定和掃描電鏡樣品的制備中得到廣泛應用[4-7]。但是傳統的插片法接種時是先將無菌的蓋玻片以約60°角度插入平板培養基上，再用接種環取孢子接種于蓋玻片與培養基內側基部結合處[3]，這種方法接種慢、難度大。因此，本研究在此傳統插片法接種方法上進行了改進，采用先接種后插片的方法，大大降低了實驗準備的操作難度并提高了工作效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 華中農業大學水產學院水產養殖國家級實驗教學示范中心保存的紫色直絲鏈霉菌（Streptomyces violaceorectus）。

1.1.2 培養基 無機鹽淀粉瓊脂培養基[6]：可溶性淀粉 10g/L，（NH4）2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 1g/L，CaCO3 3g/L，瓊脂1.5%。pH7.0～7.5，1×105Pa高壓蒸汽滅菌20min。

1.1.3 染色液 溶液A：堿性復紅（堿性品紅）0.3g，酒精（95%）10mL，用研缽研磨;溶液B：石碳酸5g、蒸餾水95mL。將溶液A及溶液B進行混合即成石碳酸復紅原液，將原液稀釋5倍用于染色。

1.1.4 無菌蓋玻片 為了方便插片時取片，將25mm×25mm蓋玻片洗凈后單層平放于鋪有濾紙的滅菌盒中，鋪滿蓋玻片后再放1層濾紙，然后繼續鋪1層蓋玻片，以此類推，鋪好后高壓蒸汽滅菌20min，滅菌結束后置于干燥箱中60℃烘干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的培養 倒平板：將滅菌之后的無機鹽淀粉瓊脂培養基融化后倒入直徑70mm的無菌培養皿，每個25mL左右，水平放置至凝固，制成厚度約5cm的平板培養基，比正常的培養基要厚，這樣蓋玻片與培養基的接觸面積就會變大。接種：接種環滅菌后挑取適量紫色直絲鏈霉菌孢子在平板上先從中間橫向接種，然后旋轉平板與其垂直方向均勻密實之字劃線（見圖1），以方便后面插片操作。與之前的先插片后接種相比，采用先接種后插片的操作方法可以在相同的平皿相同時間內中做更多的插片，并且接種的操作較之前也更方便。插片：鑷子灼燒滅菌冷卻后夾取無菌蓋玻片橫跨劃線線條以與培養基成30°～45°夾角插入固體培養基中（見圖1），夾角不宜過大，否則培養皿蓋子無法蓋好。插片數量按需而定，一般直徑70mm的平皿可以插25mm×25mm蓋玻片8～10片。插片結束后倒置于28℃培養箱培養4～5d，以滿足實驗教學要求。

1.2.2 放線菌的染色和鏡檢 取片：用鑷子小心夾取菌片，除去多余的培養基，操作過程中動作要輕，以免破壞菌片。浸染：將菌片以一定的角度慢慢放在滴有石碳酸復紅染液的載玻片上（避免產生氣泡）浸染1min左右。鏡檢：用吸水紙將蓋玻片上多余的染液吸干凈，然后在顯微鏡下進行觀察并拍照。

2 結果與分析

壓片浸染法是用鑷子夾取菌落邊緣放在染液里再用鑷子進行壓片，由于缺乏經驗，力度難以控制和取樣方法不好，導致在顯微鏡下觀察到的菌絲層疊在一起，很難分辨清楚基內菌絲和氣生菌絲。印片浸染法則只能看到孢子絲和孢子的形態，偶爾可以觀察到氣生菌絲（表1）。而采用改進之后的插片浸染法能夠發現菌絲體和孢子圖像背景層次分明、結構清晰。由圖2可知，紫色直絲鏈霉菌是由分枝狀菌絲組成，并且能很好地區分營養菌絲、氣生菌絲和孢子?；鶅染z著色淡、無隔膜、不斷裂、波曲狀;氣生菌絲同樣無隔膜、不斷裂、波曲狀，但著色較深，且比基內菌絲粗;當氣生菌絲發育到一定程度，其頂端可分化形成孢子絲（繁殖菌絲）;孢子成熟后通過橫割分裂的方式產生成串的分生孢子，孢子為橢圓形或短桿狀。

3 結論

本研究結果表明，采用改進的插片接種方法較傳統接種方法有更多優點。連續3年采用改進的插片浸染法進行放線菌形態結構觀察，老師和學生均反映改進的插片浸染法優于之前的壓片浸染法和印片浸染法，實驗效果好、成功率高、節約時間，并且可以激發學生探索微觀世界的興趣，提高教學效率和效果。

參考文獻

[1]譚鳳霞，彭本英，羅靜波.水產微生物學實驗教學體系的構建與實踐[J].長江大學學報（自然版），2011（8）：270-272.

[2]蔡信之.插片法觀察放線菌霉菌效果好[J].實驗教學與儀器，1995（2）：28.

[3]汪紅，解麗芳，王甜，等.用浸染法提高放線菌形態觀察的效果[J].西華師范大學學報（自然科學版），2011（3）：256-258.

[4]劉華松，陳羽，戴偉巧，等.1株產α-糖苷酶抑制劑放線菌的篩選與鑒定[J].微生物學雜志，2017（2）：58-61.

[5]涂璇，黃麗麗，高小寧，等.黃瓜內生放線菌的分離、篩選及其活性菌株鑒定[J].植物病理學報，2008（3）：244-251.

[6]李應祥，王為鎮，談孝鳳，等.茶云紋葉枯病拮抗放線菌的篩選[J].安徽農業科學，2014（32）：11339-11341.

[7]楊瑞，王歧，張露，等.放線菌掃描電鏡樣品制備方法比較研究[J].電子顯微學報，2014（1）：84-89.

（責編：徐世紅）