miR-152在胃癌中的表達及意義

陳麗麗， 王震凱， 劉 翔， 陳婉珍， 楊曉倩， 韋志琴， 沈蒙蒙， 劉 丹， 汪芳裕

1.浙江省臺州市路橋區蓬街鎮衛生院，浙江 臺州 318057； 2.南京中醫藥大學附屬南京市中醫院內鏡中心； 3.東部戰區南京總醫院消化內科

雖然當今社會的物質和生活條件已有較大改善，但胃癌仍是影響人類生活質量和生命的惡性疾病之一。有許多患者在發現胃癌時已是晚期，甚至早期胃癌的患者也有30%～50%存在微轉移。而胃癌的早發現、早診斷、早治療則能明顯改善患者的預后及生存質量，因此，尋找胃癌的敏感標志物及有效治療靶點有助于胃癌的早診早治。

近些年，基因表觀遺傳學的異常已經成為腫瘤病因研究的熱點之一。DNA甲基化和微小RNA(microRNAs，miRNAs)對基因轉錄后調控作用為腫瘤的發生、發展及干預開辟了新的路徑。miR-152在多種腫瘤中的表達水平均下降，如：前列腺癌[1]、卵巢癌[2]、宮頸癌[3]、乳腺癌[4]、結腸癌[5]等，而且miR-152與腫瘤的增殖能力、腫瘤大小及T分級明顯相關。但有關miR-152在胃癌方面的表達和研究仍鮮有報道。本研究主要探討miR-152在胃癌中的表達及其與胃癌預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料共收集2012年至2015年240對胃癌及癌旁正常組織(距離腫瘤組織3 cm左右)，標本均來自原南京軍區南京總醫院。以上組織來源于外科手術切除或內鏡下黏膜剝離術過程中獲取。該研究內容獲得原南京軍區南京總醫院倫理委員會同意(批準號：NJZYY2016039)及病患家屬簽字認可，操作符合臨床試驗倫理規范。不同分化程度的胃癌細胞株MKN-45(低分化)、AGS(高分化)、MKN-28(中分化)和HGC-27(未分化)和正常胃黏膜細胞株GES-1均購自中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交法：miR-152原位雜交檢測試劑盒購自丹麥Exioqon公司，原位雜交封閉液和洗滌液均購自美國Roche公司?；具^程如下：組織芯片脫蠟，于37 ℃蛋白酶K消化15 min，漂洗后梯度乙醇脫水。55 ℃預雜交30 min后，地高辛標記的miR-152探針(100 nmol/L，Bis-QD355)恒溫雜交1 h，堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1 h，NBT/BCIP黑暗處30 ℃顯色，核固紅復染。雜交過程選擇U6探針(1 nmol/L)作為陽性對照，去除探針作為陰性對照。結果判定：miR-152表達以胞質出現棕褐色顆粒為陽性染色，陽性細胞數≥10%時為陽性。

1.2.2 實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)：(1)RNA逆轉錄合成cDNA：10～25 ng 小RNA，1 μl 1×miRVana逆轉錄引物，2 μl miRVana 5×RT緩沖液。將DEPR處理過的雙蒸水加入上述液體至10 μl。

步驟如下：將1×miRVana RT引物1 μl、抽提的小RNA液10～25 ng、miRVana 5×RT緩沖液2 μl、無核酸酶純水(Nuclease-free Water)四種液體充分混勻，由無核酸酶純水定容至10 μl后移入EP管，使用瞬時離心(常溫下，6 000 r/min,10 s)進行沉淀，后在37 ℃條件下孵育30 min，再轉為95 ℃條件性孵育10 min，最后在冰塊中冷卻。

(2)qRT-PCR：PCR引物序列及擴增長度如表1所示。實驗步驟如下：將miRVana 5×PCR緩沖液5 μl、耐熱DNA聚合酶1 U、50×ROXTM0.5 μl及以上PCR所用引物(見表1)混勻，由DEPC處理過的雙蒸水加入上述液體至25 μl，使用瞬時離心(常溫下，6 000 r/min,10 s)進行沉淀。在95 ℃條件下，經過3 min預變性處理后，開始40個PCR循環，每個循環條件分別在95 ℃進行15 s，在60 ℃進行30 s。

表1 PCR引物序列及擴增長度

使用計算公式Fold change=2-ΔΔCT來分析mRNA的相對含量。內參為U6，CT值代表“當熒光強度滿足條件狀態下總共的擴增次數”。

2 結果

2.1 原位雜交方法檢測胃癌組織中miR-152的表達

原位雜交法檢測miR-152在80對胃癌組織及癌旁正常組織中的表達情況。結果發現，miR-152在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織(見圖1)。胃癌患者的臨床病理特征與miR-152表達的關系如表2所示。240例胃癌病例中，192例(80.00%)miR-152呈低表達狀態，且與患者的年齡、胃癌的分化程度、浸潤深度和TNM分期明顯相關。存在淋巴結轉移的病例中，miR-152的表達水平顯著低于無淋巴結轉移的病例。miR-152表達與患者性別、腫瘤發病部位以及腫瘤大小無相關性。

表2 miR-152表達與胃癌患者的臨床特征[例數(%)]

注：棕色染色代表miR-152的表達。A：癌旁正常組織中miR-152表達情況；B：胃癌組織中miR-152低表達；C：胃癌組織中miR-152高表達。放大100倍。

2.2 qRT-PCR檢測胃癌組織中miR-152的表達使用Taqman探針法qRT-PCR定量檢測胃癌組織及癌旁正常組織中miR-152的表達水平。miR-152在胃癌組織中的表達水平為1.39±1.02，而在癌旁正常組織中的表達水平為13.26±2.22(見圖2)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。本試驗根據腫瘤生物學行為特性及TNM分期情況，將Ⅰ～Ⅱ期歸為早期，Ⅲ～Ⅳ期歸為進展期。在早期胃癌組織中miR-152的表達水平為2.22±1.07，進展期胃癌組織中miR-152的表達水平為0.75±0.17(見圖3)。因此，在進展期胃癌組織中miR-152的表達比早期胃癌組織中的表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：與癌旁正常組織比較，★P<0.001。

注：與早期比較，#P<0.01，★P<0.001。

2.3 不同分化程度的胃癌細胞株miR-152表達情況

雖然miR-152在胃癌組織中表達顯著下調，但在不同分化程度的胃癌組織中，miR-152的表達仍存在顯著性差異(P=0.016)，初步提示miR-152與胃癌的細胞生物行為能力密切相關。為進一步明確miR-152表達水平與胃癌細胞生物行為能力的相關性，本試驗選取了4種代表不同分化程度的人胃癌上皮細胞株進行miR-152的定量分析。測得的結果與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1進行對照比較。結果發現，胃癌細胞株中的miR-152表達量較正常胃黏膜細胞株顯著減少(見圖4)。在MKN-45、AGS、MKN-28和HGC-27細胞中miR-152相對表達水平分別為GES-1細胞的23%、48%、52%和22%。在MKN-45和HGC-27差分化的胃癌上皮細胞株中，miR-152表達水平顯著低于分化程度較好的AGS和MKN-28細胞株(P<0.001)，該結果與臨床胃癌組織標本的檢測結果一致。上述數據表明，miR-152表達水平與胃癌細胞分化程度有關，而差分化的MKN-45和HGC-27細胞株中的miR-152的表達減少最顯著。

注：與GES-1比較，*P<0.05，★P<0.001。

3 討論

miRNA是一類長度約為22 nt RNA序列的控制性非編碼RNA，可以通過結合靶基因3′UTR上的互補區域來抑制基因的表達[6]。研究表明，有的miRNA同時能作用于多個靶基因，甚至達到上百個靶向基因。因此，自然界絕大部分生物基因可能是miRNA的靶向基因[7]。同時，miRNA在許多領域發揮著廣泛的作用，例如：參與機體的神經形成、細胞的分化、增殖與凋亡、生物內分泌功能、干預脂肪代謝等方面。另一方面，miRNA自身可以作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生和發展，還能通過調控靶基因的轉錄后的表達引起靶基因沉默。

miR-152屬于抑癌miRNA，在多種腫瘤組織中存在表達下降，導致癌基因的活化，在腫瘤的形成中發揮重要作用。Tang等[3]通過qRT-PCR檢測宮頸癌組織中的miR-152的表達情況，發現宮頸癌組織及癌細胞株中的miR-152表達顯著低于癌旁正常組織及正常宮頸上皮細胞。汪毅等[5]發現，在結直腸癌組織中miR-152的表達水平低于相應的癌旁組織，且miR-152表達水平與結直腸癌患者的淋巴結轉移和TNM分期有關。Theodore等[1]證實，在不同人種中miR-152的不同表達水平決定了前列腺癌的發病率及預后，說明其在腫瘤發病前期的重要作用。本研究結果與上述研究相似，80.00%(192/240)胃癌患者的胃癌組織中miR-152表達比癌旁正常組織的表達明顯減少，且與胃癌的浸潤深度和TNM分期明顯相關。而且在胃癌的不同階段(早期癌vs進展期癌)，miR-152的表達水平也存在顯著性差異。雖然胃癌上皮細胞株(MKN-45、AGS、MKN-28和HGC-27)中miR-152的表達水平均較GES-1顯著降低，但MKN-45與HGC-27細胞株中miR-152表達水平顯著低于MKN-28和AGS。從體外細胞水平證實miR-152的低表達與胃癌細胞的生物功能具有相關性。上述試驗結果表明，miR-152可能在胃癌發生發展過程中發揮重要作用，其低表達的程度可作為臨床上判斷胃癌預后以及病理評估的分級標志物。

目前的證據表明，具有表觀遺傳修飾作用的miRNA可能在不同的腫瘤中發揮重要的觸發作用。據報道，miR-152能靶向DNMT1和誘導HBV相關肝細胞癌DNA異常甲基化[8]。但另有研究卻得到相反的結果：在NiS細胞中恰恰是由于DNMT1誘導miR-152高甲基化而導致其低表達。這個研究揭示了NiS細胞誘導的惡性轉化中，miR-152和DNMT1存在雙向負反饋調控[9-10]。由于miR-152啟動子區域存在經典的CpG島，使DNMTs家族誘導miR-152高甲基化狀態成為可能。因此，近來發現miR-152的高甲基化導致的低表達現象存在于一些胃腸道腫瘤和膽管癌[11-12]。也有研究發現子宮內膜癌的細胞株和原發腫瘤中存在DNA高甲基化和miR-152的下調相關[13]。另有研究認為，miR-152 CpG島的異常甲基化與畸形白血病的臨床預后密切相關[14]。我們前期的研究中，將miR-152模擬物和具有突變型3′UTR的DNMT1過表達載體共轉染胃癌細胞株，雖然轉染細胞中DNMT1蛋白表達明顯增加，但并未出現miR-152表達的抑制或低表達[15]。因此，在胃癌機制研究中，miR-152低表達和DNMT1過表達孰因孰果尚未明確，兩者間是如何被誘導產生對話交聯、如何對兩者進行有效調控仍需進一步闡釋。

總之，miR-152在胃癌組織及胃癌細胞中表達明顯下調，與胃癌的分化程度、腫瘤浸潤深度及腫瘤分期密切相關，其可能成為胃癌診斷與評估的重要生物學標志物。