AMPA受體在精神分裂癥模型小鼠小膠質細胞和髓鞘發育中的作用*

何子文 張紅旗

精神分裂癥是一種影響中樞神經系統的脫髓鞘和炎癥性疾病，其特征為髓鞘丟失、神經膠質增生和隨后的軸突丟失的局灶性病變[1]。先前研究強調了膠質細胞在精神分裂癥易感性中的重要作用[2]。在發育過程中，少突膠質前體細胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)經歷了一個復雜的增殖、遷移、分化和髓鞘形成序列[3]。髓鞘再生被認為是通過激活OPCs啟動的。最近一項獨立的全基因組關聯研究已經確定了在小膠質細胞中高度表達的精神分裂癥相關基因座，包括谷氨酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor，AMPAR)基因[4]。AMPAR與精神分裂癥的病理生理學相關，因為它們在突觸事件中發揮核心作用，包括可塑性、神經元成熟、記憶形成和突觸發生[5]。在中樞神經系統(CNS)細胞中，AMPAR在小膠質細胞中表達最高[6]。然而，AMPAR在精神分裂癥小膠質細胞和髓鞘發育中的作用尚未被探索。因此，本研究參照文獻方法在雙環己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)誘導的精神分裂癥模型小鼠中建立了一條AMPAR條件性敲除線(GluA1-3亞基的敲除)[7]，以此闡明 AMPAR在小膠質細胞和髓鞘發育中的潛在調節作用。其中，CPZ是一種銅螯合劑，可選擇性地損傷中樞神經系統中的髓鞘形成細胞少突膠質細胞[8]。因此，CPZ誘導的動物模型已被用于模擬與精神分裂癥相關的白質病變和行為[9]。

1 對象與方法

1.1 對象 選取15只AMPAR條件性敲除線(GluA1-3亞基的敲除，KO)和15只野生型(WT)小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，分別納入KO組和WT組，飼養在無病原體的動物設施中(光/暗循環)置于標準動物室條件下[溫度(21±1) ℃；濕度55%～60%；12 h)。為了檢查AMPAR在髓鞘再生中的作用，在CPZ模型中將WT與KO小鼠進行了比較。CPZ暴露會導致少突膠質細胞死亡和嚴重的脫髓鞘，而CPZ撤出會導致自發的髓鞘再生[8]。在本研究中，給小鼠喂食含0.2% CPZ(質量分數百分比，w/w)的混合鼠飼料4周以誘導脫髓鞘(4周時間點)，然后喂食不含CPZ食物3周以使髓鞘再生(4+3周時間點)。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質細胞培養[10]解剖P1-3小鼠的小鼠皮質，并將其放入2 ml的冷Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中。用5 ml血清移液管和玻璃巴斯德移液管研磨破壞組織。破壞的腦組織以300×g的速度離心5 min，然后將顆粒重新懸浮在1 ml的DMEM 中。將細胞懸液通過40 μm細胞過濾器過濾，并在含有10% FBS和1% Pen-Strep的10 ml DMEM中培養。24 h后，用1×PBS洗滌細胞，并用20 ml DMEM/FBS/P/S孵育11～13 d。為了獲得小膠質細胞，將燒瓶以125 rpm的速度搖動1～2 h，收集培養基并在涂有FBS的50 ml錐形管中以300 × g離心5 min。然后將小膠質細胞顆粒重新懸浮并以75 000個細胞/孔的密度接種在96孔板上，在含有10% FBS和1% P/S的DMEM中培養。

1.2.2 電子顯微鏡(Electron Microcopy，EM) 通過用冷PBS灌注固定小鼠，然后在PBS中加入4% PFA。解剖大腦并在4 ℃下將兩個中央1 mm矢狀切片固定在改良的Karnovski固定劑中至少24 h。用超純水洗滌后，組織在室溫下在1%三氧化鋨中固定3 h。將組織在超純水中洗滌，并在4 ℃下用1% (w/v) 醋酸鈾酰染色過夜。然后通過一系列升高的乙醇濃度對樣品進行脫水，在環氧丙烷中沖洗兩次，并嵌入環氧樹脂Eponate-12 (Ted Pella)。使用UMC超薄切片機(德國Leica公司)切割半薄的500 nm切片并轉移到碳涂層的組織學載玻片上。然后用4%醋酸雙氧鈾水溶液和0.1%雷諾檸檬酸鉛對切片染色15 min，用超純水沖洗并在加熱板上干燥。使用配備場發射槍的GeminiSEM 300(德國Zeiss公司)進行掃描電子顯微鏡檢查。

1.2.3 免疫組織化學染色、成像和分析 小鼠大腦用20%甘油和2%二甲亞砜處理過夜，以防止出現冷凍偽影。然后將樣本嵌入MultiBrain?Technology (美國NeuroScience Associates公司)，用于在明膠基質中進行冠狀切片。在甲醛溶液中固化后，將塊浸入用碎干冰冷卻的2-甲基丁烷中快速冷凍，并安裝在AO 860切片機的冷凍臺上。MultiBrain?塊在切片機上以30 μm的設置進行冠狀切片。對于Solochrome染色，每隔12個切片以360 μm的間隔固定在涂有明膠的載玻片上，并按照以下順序進行風干：95%乙醇，95%乙醇/甲醛；95%乙醇、70%乙醇、dH2O，然后加入到80 ml Solochrome染色溶液(1.5% Solochrome，2.5% v/v硫酸)、320 ml dH2O、100 ml 4%硫酸鐵銨，用自來水沖洗，在鐵氰化鉀-硼酸鈉中分化，在自來水中沖洗，用中性紅輕輕復染，脫水，在二甲苯中澄清并蓋上蓋玻片。

對于免疫化學，以360 μm的間隔每隔12個切片進行自由漂浮染色。從一抗開始的所有孵育溶液均使用Tris緩沖鹽水(TBS)，以Triton X-100作為載體；所有沖洗均使用TBS。在過氧化氫處理后，切片在室溫下與一抗孵育過夜(Iba1∶1∶500，dMBP∶1∶100)。沖洗后，應用生物素化二抗(產生一抗的宿主動物的抗IgG)。進一步沖洗后，使用ABC溶液(抗生物素蛋白-生物素-HRP復合物；美國CA公司)。再次沖洗切片，然后用發色劑：二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)和過氧化氫處理以產生可見的反應產物。對于dMBP免疫化學染色切片用淺色硫氨酸Nissl染色劑復染。

在Leica SCN400顯微鏡(德國Leica公司)對腦組織切片進行成像。使用在高性能計算集群上運行的MATLAB(美國Mathworks公司)以盲法進行圖像分析。在每只動物的匹配組織切片水平上手動繪制由胼胝體中的病變區域組成的感興趣區域(ROI)。使用顏色閾值和形態學操作對dMBP、Iba1和Solochrome陽性染色區域進行分析。從每只動物3個ROI中取平均值。

1.2.4 吞噬作用和遷移測定 對于凋亡小膠質細胞的吞噬作用，將小膠質細胞與1 μM Staurosporine 孵育過夜以誘導細胞凋亡，然后用250 nM Cytotox Red標記，洗滌并加入活的小膠質細胞。2 h后，使用Incucyte S3軟件中的自定義分析腳本測量是否存在未清除的Cytotox Red陽性小膠質細胞。

使用IncuCyte實時動態細胞成像分析系統(美國 Essen Bioscience公司)進行遷移測定。前一天將原代小膠質細胞接種在DMEM/P/S中，并用創口機制造“劃痕”。每2 h采集一次孔的圖像，持續72 h，并使用相對傷口密度(傷口區域中的細胞密度相對于傷口區域外的細胞密度)來量化遷移。

1.2.5 統計學方法 使用SPSS 21.0處理數據。所有數據均以至少三個獨立實驗的平均值 ± 標準差的形式呈現。使用Student’st檢驗(雙尾)或單因素方差分析(ANOVA)檢驗分析實驗結果。P< 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AMPAR在CPZ誘導的精神分裂癥髓鞘再生中的作用 CPZ喂食4周后，觀察到WT組和KO組小鼠的胼胝體都出現了強烈的脫髓鞘(圖1A，中圖，深藍色染色缺失)。然而，在KO組中，整體細胞密度(中性紅色斑點)降低(圖1A，中圖，核染色)?；謴?周后，與WT組相比，KO組的髓鞘再生受損(P<0.001)。為了證實在KO組小鼠中觀察到的髓鞘再生受損，通過EM直接評估有髓軸突。在4周時間點，WT組小鼠胼胝體中的有髓軸突幾乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢復(圖1B)。KO組小鼠在4周時剩余的有髓軸突多于WT組(P<0.01)，表明脫髓鞘過程可能會受到AMPAR缺失的影響。在4 + 3周時，KO組小鼠的有髓軸突比WT組小鼠少(P<0.05)(圖1B)，表明AMPAR在CPZ喂食后的髓鞘再生中起重要作用。

2.2 AMPAR在小膠質細胞對脫髓鞘反應中的作用 脫髓鞘后的第一個細胞事件是小膠質細胞激活和浸潤到病變中[11]。在基線時，胼胝體中的Iba1(小膠質細胞)染色沒有差異。然而，在CPZ喂食4周后，與WT組相比，KO組小鼠的小膠質細胞浸潤減少(P<0.0001)。然而，在4+3周時間點，在WT組和KO組小鼠的病變中觀察到相似數量的小膠質細胞(圖2A)。接下來研究觀察了從出生后第1天(P1)-出生后第3天(P3)的WT組和KO組小鼠大腦體外分離的小膠質細胞傷口愈合情況。與WT組小膠質細胞相比，KO組小膠質細胞在傷口閉合方面表現出缺陷(P<0.05)。見圖2B。

2.3 AMPAR在小膠質細胞吞噬中的作用 通過對降解的髓鞘堿性蛋白 (dMBP) 進行免疫染色來檢查病變中的髓鞘碎片。在4周和4+3周時間點觀察到KO較WT中央和外側胼胝體中有過多的髓鞘碎片(P<0.01)，見圖3A。證明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。研究進一步通過使用熒光激活細胞分選(FACS)從脫髓鞘的KO胼胝體中分選Annexin V+和Annexin V-細胞，觀察到KO中的Annexin V+細胞比例高于WT(平均為4.38%vs.1.14%)。與Annexin V-細胞相比，Annexin V+細胞表達的小膠質細胞標記基因水平較高，而其他CNS細胞類型表達的基因水平較低(圖3B)。這些結果表明，脫髓鞘期間KO胼胝體中的垂死小膠質細胞比WT中更多，這可能是由于KO中凋亡小膠質細胞的清除受損。為了具體評估這一假設，在WT組和KO組小膠質細胞培養物中添加了凋亡小膠質細胞(用Cytotox Red標記)，并觀察到KO組小膠質細胞對凋亡細胞的清除較WT組小膠質細胞減少(P<0.01)，見圖3C?？傊?，這些結果表明，AMPAR是脫髓鞘后小膠質細胞吞噬作用所必需的。

注：A、胼胝體的降解MBP (dMBP)染色顯示基線時沒有dMBP，而在4周和4 + 3周時間點，KO中的dMBP水平升高(比例尺=500 μm)。B、小膠質細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、內皮細胞和OPCs的FACS分選的Annexin V-和Annexin V+細胞的基因組分數。C、通過星形孢菌素培養小膠質細胞以誘導細胞凋亡，用Cytotox Red標記，然后用WT或KO小膠質細胞孵育。2 h后平均熒光強度的變化。NS，不顯著；*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.0001

3 討論

精神分裂癥是一種嚴重而復雜的精神疾病，表現為多種癥狀和高發病率，對患者和社會產生深遠影響[1]。然而，精神分裂癥的病因和發病機制尚未完全闡明，并且在揭示精神分裂癥的發病機制和發現新療法方面仍然存在挑戰[12]。研究精神分裂癥的發病機制和評價藥物療效需要合適的動物模型。CPZ是一種銅螯合劑，可選擇性地損傷CNS中的髓鞘形成細胞少突膠質細胞[8]。因此，CPZ誘導的動物模型已被用于模擬與精神分裂癥相關的白質病變和行為。本研究采用CPZ喂食4周在小鼠中誘導精神分裂癥模型，并發現小鼠胼胝體中的有髓軸突和髓鞘幾乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢復，證實了有髓軸突和髓鞘丟失參與精神分裂癥的病理過程。

小膠質細胞是髓鞘再生所必需的，因為消融小膠質細胞或阻斷小膠質細胞信號傳導會導致髓鞘再生受損[13]。此外，與年齡相關的小膠質細胞活動下降會導致髓磷脂清除受損和髓鞘再生缺陷[14]。許多精神分裂癥研究都支持谷氨酸假說，并集中在谷氨酸受體AMPAR的失調上，因為它們在突觸事件中發揮核心作用，包括可塑性、神經元成熟、記憶形成和突觸發生[15]。在這項研究中，通過使用在神經元發育早期消除GluA1、2和3 AMPAR亞基的小鼠系，檢查了小膠質細胞中高度表達的AMPAR在髓鞘再生中的作用。結果證明了AMPAR是小膠質細胞對脫髓鞘反應所必需的，這是髓鞘再生過程的關鍵組成部分。此外，還發現AMPAR敲除小鼠的小膠質細胞在吞噬和遷移方面都存在缺陷，從而導致髓鞘再生受損。

最近已經確定了小膠質細胞在精神分裂癥易感性中的作用[6]。本研究結果證明了AMPAR在小鼠脫髓鞘/髓鞘再生過程中小膠質細胞活化中的作用。在培養的人骨髓細胞中，抑制AMPAR會降低髓鞘吞噬作用和抗炎細胞因子IL-10的表達[16]。重要的是，與健康對照組相比，來自精神分裂癥患者的MDM吞噬髓鞘和上調IL-10的能力降低，并且表達的AMPAR(RNA和蛋白質)水平降低[17]。髓鞘碎片抑制CNS的恢復，是CNS修復的主要障礙之一[18]。特別是，髓磷脂碎片已被證明可抑制OPC分化和隨后的髓鞘再生[19]。然而，所涉及的細胞和分子機制在很大程度上是未知的。本研究在4周和4+3周時間點觀察到KO組較WT組小鼠中央和外側胼胝體中有過多的髓鞘碎片，證明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。此外，還證明了脫髓鞘期間KO組胼胝體中的垂死小膠質細胞比WT組中更多，這可能與小膠質細胞的清除受損有關。

總之，本研究在脫髓鞘和髓鞘再生的CPZ誘導的精神分裂癥模型中使用GluA1-3亞基敲除小鼠證實了AMPAR是小膠質細胞對脫髓鞘和隨后的髓鞘再生的反應所必需的，并且AMPAR在小膠質細胞吞噬和遷移中具有重要作用。然而，本研究尚不清楚AMPAR通過何種途徑介導這些作用，未來有待進一步研究。