羅沙司他減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用和機制研究

姚金東 王妮妮 劉亞然

【摘要】 目的：研究羅沙司他減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用和機制。方法：選取20只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為生理鹽水組和羅沙司他組，每組10只。生理鹽水組腹腔注射生理鹽水，羅沙司他組腹腔注射羅沙司他。結扎冠狀動脈左前降支45 min，再灌注3 h。記錄小鼠心肌梗死面積;檢測小鼠血漿中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）水平;TUNEL檢測小鼠心肌細胞凋亡;免疫印跡檢測小鼠心肌組織中低氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達;實時定量PCR檢測小鼠心肌組織中Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達。結果：與生理鹽水組比較，羅沙司他組可明顯減小小鼠心肌梗死面積，降低血漿心肌酶水平，減輕心肌細胞凋亡，上調心肌組織中HIF-1α、Ddit4 mRNA和Ndufa4l2 mRNA的表達水平（P<0.05）。結論：羅沙司他可通過上調HIF-1α和低氧反應基因Ddit4和Ndufa4l2的表達，減輕實驗小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

【關鍵詞】 羅沙司他 心肌缺血再灌注損傷 低氧誘導因子 凋亡

Study on the Effect and Mechanism of Roxadustat in Alleviating Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Mice/YAO Jindong， WANG Nini， LIU Yaran. //Medical Innovation of China， 2022， 19（08）： 0-019

[Abstract] Objective： To study the effect and mechanism of Roxadustat in alleviating on myocardial ischemia reperfusion injury in mice. Method： A total of 20 male C57BL/6 mice were randomly divided into normal saline group and Roxadustat group， 10 mice in each group. The normal saline group was intraperitoneally injected with normal saline， and the Roxadustat group was intraperitoneally injected with Roxadustat. The left anterior descending coronary artery was ligated for 45 min and reperfusion for 3 h. The area of myocardial infarction in mice was recorded; and the levels of creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） in plasma were detected; TUNEL was used to detect myocardial cell apoptosis in mice; Western blotting was used to detect the expression of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） in mice myocardium; the mRNA expressions of Ddit4 and Ndufa4l2 in mice myocardium were detected by real-time PCR. Result： Compared with the normal saline group， Roxadustat group could significantly reduce the myocardial infarction area， reduce the level of plasma myocardial enzymes， reduce cardiomyocyte apoptosis and up-regulate the expression levels HIF-1α， Ddit4 mRNA， Ndufa4l2 mRNA in myocardial tissue （P<0.05）. Conclusion： Roxadustat alleviates myocardial ischemia reperfusion injury in mice by up-regulating the expression of HIF-1α and hypoxia response genes Ddit4 and Ndufa4l2.

[Key words] Roxadustat Myocardial ischemia reperfusion injury Hypoxic-inducible factor Apoptosis

First-author’s address： Panjin Liaoyou Gem Flower Hospital， Liaoning Province， Panjin 124000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.08.004

早期再灌注是心肌梗死發生后縮小梗死面積、維持心功能最有效的治療方法，然而，缺血性心臟病仍然是導致心力衰竭的主要原因[1]。為進一步改善心血管疾病的預后，亟須探究缺血性心臟病管理新的方法和新策略。缺血預處理已被證實是預防缺血/再灌注損傷的有效方法。為在藥理學上實現缺血預處理，已有研究報道了一些潛在的可介導缺血預處理的藥物，如腺苷、蛋白激酶C、阿片受體和活性氧等[2]。此外，多項研究表明，抑制脯氨酸羥化酶結構域蛋白或過表達低氧誘導因子-1α（HIF-1α）可顯著減輕缺血性損傷[3-4]。作為缺氧誘導型應激反應基因，DNA損傷誘導轉錄物4（Ddit4）和Ndufa4l2是HIF-1α的直接靶基因，其與細胞壓力應激、凋亡、自噬等生命進程息息相關[5]。

先前的研究報道脯氨酸羥化酶抑制劑能夠上調紅細胞生成素并促進肝臟中紅細胞產生，隨后開發了第一類脯氨酸羥化酶抑制劑——羅沙司他[6]。羅沙司他可穩定提高促紅細胞生成素和血紅蛋白水平，用于模擬缺氧的自然反應，最初被用于治療慢性腎病患者的貧血[7]。然而，羅沙司他對心肌缺血/再灌注損傷的治療效果仍有待充分闡明。因此，在本研究中，筆者建立心肌缺血小鼠模型，再灌注后觀察羅沙司他對小鼠心梗面積和HIF-1α信號通路和低氧反應基因的影響，探討羅沙司他預處理是否能保護小鼠心肌缺血再灌注損傷，以及其潛在的機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 羅沙司他[阿斯利康（中國）]，DMSO（上?？脐簧锕こ蹋?，伊文思藍、TTC染色劑（美國Sigma公司），血漿肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL檢測試劑盒（上海碧云天），HIF-1α抗體（#36169，美國CST公司）。

1.2 實驗動物分組及小鼠心肌缺血再灌注模型制備 于2019年6月-2020年9月進行實驗。選取20只12周齡雄性C57BL/6小鼠，體重20～26 g，隨機分為兩組，每組10只。3 h后，所有小鼠手術區域備皮消毒，行異氟醚（生產廠家：河北一品制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H19980141，規格：100 mL）麻醉，于胸骨左側第3、4肋間剪開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，打開胸腔，用開胸器撐開肋間、充分暴露心臟，剪開心包，在體視顯微鏡下仔細辨認，可見在心耳下緣或左側出現一條粉紅色血管即為左冠狀動脈的前降支，開胸后迅速結扎冠狀動脈左前降支，45 min后解開結扎，結扎冠狀動脈的前降支后看到左心室前壁心肌變白，局部收縮運動受限，左心耳充盈脹滿，心電圖見ST段持續弓背抬高，表明心肌缺血再灌注模型成功。3 h后靜脈取血1 mL，處理小鼠以進行后續實驗。對照組腹腔注射生理鹽水，羅沙司他組腹腔注射羅沙司他（溶于DMSO溶液）[生產廠家：琺博進（中國）醫藥技術開發有限公司，批準文號：國藥準字H20180024，規格：50 mg]25 mg/kg。

1.3 伊文思藍/TTC染色 各組小鼠再灌注3 h后，從右側頸內靜脈注入1%伊文思藍。小鼠唇染藍后，剪下心臟，剔除心房，-80 ℃速凍，切片。平行房室溝將左室切成1.5～2.0 mm厚切片。放入2%的TTC染液中小心避光浸染，30 ℃避光孵育30 min，并隨時觀察樣本顏色變化。隨后，切片置于10%中性福爾馬林中固定24 h。用生理鹽水沖洗組織表面多余的染色液，拍照記錄各組小鼠心肌梗死面積。

1.4 血漿中心肌酶水平檢測 再灌注3 h后，小鼠靜脈取血1 mL，分別按說明書用血漿CK和LDH檢測試劑盒檢測小鼠血漿中CK和LDH水平。

1.5 心肌細胞凋亡檢測 再灌注3 h后，取小鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切厚度為3～4 μm的組織切片。按照說明書操作進行TUNEL染色。小鼠正常心肌細胞呈藍色熒光，凋亡心肌呈紅色。分別取3個不同的視野，熒光顯微鏡下計數TUNEL染色陽性的小鼠心肌細胞數量。

1.6 免疫印跡 再灌注3 h后，摘取小鼠心臟，RIPA裂解液冰上裂解，4 ℃ 12 000 r離心5 min，取上清，加SDS上樣緩沖液100 ℃變性10 min后，即得心肌組織蛋白。行SDS-PAGE電泳、轉膜，BSA封閉1 h，孵育一抗（HIF-1α、GAPDH）4 ℃過夜，漂洗后孵育二抗4 ℃約4 h，ECL增強化學發光法顯影，凝膠成像系統檢測各組小鼠心肌組織中相關蛋白的相對含量。

1.7 實時熒光定量PCR 用Trizol試劑提取小鼠心肌中的總RNA，反轉錄為cDNA后，以GAPDH為內參，SYBR法進行實時熒光定量PCR擴增，各基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。引物序列為：

（1） GAPDH。 F，5’-GGCACAGTCAAGGCTAGAATG-3’，R，5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。（2）Ddit4：F，5’-TGGACAGCAGCAACAGTGG-3’;R，5’-TGCATCAGGTTGGCACACAG-3’。（3）Ndufa4l2：F，5’-CTGGGACAAGATGGCAGGAAC-3’;R，5’-GGGCAAGTCGCAGCAAGTAGA-3’。

1.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羅沙司他對心肌缺血再灌注小鼠梗死面積的影響 在小鼠冠狀動脈左前降支結扎術后3 h給予羅沙司他腹腔注射25 mg/kg，與生理鹽水組相比，再灌注3 h后，羅沙司他可顯著誘發小鼠對心肌缺血再灌注損傷的抵抗，表現為小鼠心肌梗死面積縮?。ㄎ慈旧珔^域）;再灌注3 h后，兩組危險區面積比較，差異無統計學意義（P>0.05）;羅沙司他組心肌梗死面積/危險區面積百分比較生理鹽水組顯著下降（P<0.05）。見表1、圖1。

2.2 羅沙司他對心肌缺血再灌注小鼠血漿心肌酶水平的影響 小鼠行心肌缺血再灌注后，與生理鹽水組相比，羅沙司他組小鼠血漿CK、LDH的水平均顯著下降（P<0.05），見表2。

2.3 羅沙司他對心肌缺血再灌注小鼠心肌細胞凋亡的影響 小鼠行心肌缺血再灌注后，與生理鹽水組小鼠心肌中TUNEL陽性細胞數（214.37±20.65）/mm2相比，羅沙司他組（96.45±11.94）/mm2顯著減少（t=-15.633，P<0.001），見圖2。

2.4 羅沙司他對心肌缺血再灌注小鼠心肌HIF-1α表達的影響 與生理鹽水組小鼠心肌中HIF-1α的表達水平（1.14±0.10）相比，羅沙司他組（1.62±0.25）顯著升高（t=5.637，P<0.001），見圖3。

2.5 羅沙司他對心肌缺血再灌注小鼠心肌低氧反應基因表達的影響 結果顯示，與生理鹽水組相比，羅沙司他組小鼠心肌中Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05），見表3、圖4。

3 討論

近年來，世界范圍內心肌梗死的發病率顯著增加，嚴重威脅人類健康?；颊叩男募」Ｋ烂娣e與其長期臨床預后密切相關，早期經皮冠狀動脈介入再灌注是現有減少心梗后梗死面積和改善臨床預后的最有效策略[8]。然而，心肌梗死仍然是心力衰竭的常見誘因，且此類患者的死亡率很高。因此，針對減輕心肌缺血損傷作用的心臟保護策略顯得至關重要。盡管目前已經報道了一些潛在的心臟保護療法，但仍缺乏針對再灌注損傷的治療方法和藥物。因此，筆者通過建立心肌缺血小鼠模型，探討羅沙司他預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，以及其潛在的機制。

羅沙司他是全球首個口服強效可逆低氧誘導因子脯氨酸羥化酶抑制劑，是阿斯利康中國在國內研發的Ⅰ類新藥，主要用于治療慢性腎病透析患者貧血。為了維持更持久的藥效，羅沙司他臨床上治療慢性腎臟病患者貧血通常采用間歇性給藥策略。羅沙司他的半衰期約為10 h，每周給藥三次，可使低氧誘導因子（HIF-1）轉錄活性在兩次給藥之間恢復到基線水平，并誘導HIF-1及其靶基因介導的紅細胞生成[9]。在本研究中，筆者首次將羅沙司他預處理應用在心肌缺血實驗小鼠上，發現給予羅沙司他預處理的小鼠，其心肌缺血再灌注后心肌梗死面積顯著減少，心肌酶水平降低，心肌凋亡程度減輕，心肌組織中HIF-1α、Ddit4和Ndufa4l2的表達均顯著升高。

HIF-1α是在心血管系統生理和病理中發揮關鍵作用的轉錄因子。西門子等在1991年首次發現HIF-1α作為促紅細胞生成素的轉錄因子[10];另有學者研究揭示了HIF-1α在常氧下被VHL降解、以及缺氧下HIF-1α激活的機制[11]。在缺氧情況下，HIF-1α由抑制脯氨酸羥化酶結構域蛋白誘導產生，在缺血預處理扮演著重要的角色。在復氧條件下，脯氨酸羥化酶低氧誘導因子-1α被希佩爾林道（VHL）連接，募集泛素連接酶，進一步降解和泛素化蛋白酶體。與此相反，在缺氧條件下，HIF-1α的羥基化以及接下來的泛素化和降解均中止[12-13]。因此，HIF-1α在細胞中可作為轉錄和非轉錄因子聚集。在本研究中，筆者發現羅沙司他可以顯著減少小鼠心肌梗死面積，顯著升高小鼠心肌中HIF-1α的表達，從而減輕實驗小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

Ddit4是一種高度保守的細胞應激性蛋白，在缺氧、DNA損傷、內質網應激、能量匱乏、營養消耗等細胞應激情況下顯著高表達，已被報道參與調節細胞壓力應激、DNA損傷修復、凋亡和自噬等細胞進程[14]。作為缺氧誘導型應激反應基因，Ddit4基因是HIF-1α的直接轉錄靶點。Ndufa4l2蛋白是線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞基家族的一員。研究表明，Ndufa4l2蛋白是唯一在低氧環境下高表達的線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞基蛋白，且其基因是HIF-1α的直接靶基因。在低氧環境下，嗜鉻細胞瘤細胞以及腦細胞等的Ndufa4l2蛋白水平均高表達，Ndufa4l2參與介導細胞低氧適應性以及損傷保護等生理病理機制[15]。研究證實，在缺氧/復氧心肌細胞模型中，Ndufa4l2可通過調節線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞基蛋白減輕心肌細胞凋亡、改善線粒體功能障礙，進一步預防心肌缺血再灌注損傷[16]。此外，丁苯酞可通過HIF-1α/Ndufa4l2調節線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞基蛋白表達，進一步保護線粒體、減輕氧化應激，發揮對PC12細胞的保護作用，可能參與腦缺血損傷的修復[17]。本研究結果表明，羅沙司他組小鼠心肌中HIF-1α的表達顯著上調，且Ddit4和Ndufa4l2的mRNA表達水平均顯著升高，提示羅沙司他可上調HIF-1α以及低氧反應基因Ddit4和Ndufa4l2的表達，進而減輕實驗小鼠的心肌缺血再灌注損傷。

然而，本研究尚存在一定不足。例如，本研究雖揭示了羅沙司他可通過調節心肌中HIF-1α表達進而減輕小鼠的心肌缺血再灌注損傷，但關于羅沙司他是如何作用在小鼠心肌HIF-1α上的，是通過通路調節還是與之直接相結合，是否存在其他靶點，尚不清楚，有待進一步深入探究。

綜上所述，本研究發現羅沙司他可通過上調HIF-1α和低氧反應基因Ddit4和Ndufa4l2的表達，減輕實驗小鼠的心肌缺血再灌注損傷，提示羅沙司他藥理學預處理可能成為對抗心肌缺血再灌注損傷的新策略。

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（收稿日期：2021-07-30） （本文編輯：姬思雨）