鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤微生物多樣性及酶活性的影響

嚴少娟 劉怡萌 孫艷麗 林興生 羅海凌 林輝 林占熺 孫紅英

摘 要：為探明鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤微生物多樣性及酶活性的影響，該文設置了7個鹽堿梯度，利用SPSS和Illumina高通量測序分析巨菌草根際土壤生理指標和微生物多樣性。結果表明：（1）各處理間，巨菌草根際土壤真菌和細菌結構均存在差異;12‰鹽堿濃度下，真菌優勢菌綱為糞殼菌綱（68.5%）、散囊菌綱（16.3%），細菌優勢菌綱為綠彎菌綱（8.5%）、擬桿菌綱（13.5%）、芽單胞菌綱（5.6%）和δ-變形菌綱（3.7%）;6‰鹽堿濃度時，真菌優勢菌綱為座囊菌綱（27.7%），細菌優勢菌綱為厭氧繩菌綱（2.4%），當鹽堿濃度提高至12‰時，該優勢菌群的相對豐度分別降至2.5%和0.007%;真菌和細菌群落Chao指數和Shannon指數隨著鹽堿濃度的升高而降低，且與土壤鹽堿濃度顯著相關（P<0.01）。（2）低濃度鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤脲酶、多酚氧化酶、堿性磷酸酶活性均有促進作用，當鹽堿濃度超過8‰時，土壤多酚氧化酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶活性受到抑制;種植巨菌草后，土壤有機質含量顯著提高（P<0.05）且鹽堿濃度顯著降低（P<0.05）;種植巨菌草對土壤鹽堿度的中和能力在中高濃度下較弱;鹽堿濃度為6‰時，巨菌草產量最高，且土壤中的速效養分和有機質含量均高于其他鹽堿濃度。該研究表明，巨菌草能通過調節酶的濃度來適應中低濃度鹽堿環境，且在不同濃度的鹽堿土壤中，產生相應的優勢菌群來適應該環境，種植巨菌草對中低濃度鹽堿土壤有一定改良作用。

關鍵詞： 鹽堿脅迫， 土壤微生物， 理化性質， 土壤肥力， 耐鹽植物

中圖分類號：Q948.12

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2022）03-0491-10

Analysis of microbial diversities and enzyme activities of

rhizosphere soil of? Pennisetum giganteum （giant juncao）

under different degrees of saline-alkali stress

YAN Shaojuan1，2， LIU Yimeng2，3， SUN Yanli4， LIN Xinsheng2， LUO Hailing2，

LIN Hui2， LIN Zhanxi2， SUN Hongying1，2*

（ 1. College of Resource and Environment， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. National Engineering Research Center of Juncao， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 3. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 4. Lanshan Forest Bureau of Linyi， Shandong Province， Linyi 276001， Shandong， China ）

Abstract：Salinty and alkali are the serious stress in arid and semiarid area， which has a bad effect on plant growth. It is necessary for us to explore the variety of microbial community and the activity of enzyme in rhizosphere of Pennisetum giganteum（giant juncao） under saline-alkali environment. As a result， we set up the experiment with seven different kinds of saline-alkali concentrations， analyze the difference significance and correlation of physiological data under different saline-alkali concentrations with the method of SPSS， and analyzed the diversities of microbial communities with the method of Illumina high-throughput sequencing. The results were as follows： （1） The composition of microbial communities in rhizosphere soil of giant juncao differed at different saline-alkali stresses; The dominant groups were Sordariomycetes （68.5%）， Eurotiomycetes （16.3%）， Chloroflexia （8.5%）， Bacteroidia （13.5%）， Gemmatimonadetes （5.6%） and δ-Proteobacteria （3.7%） at the 12‰ saline-alkali concentration; The relative abundance of the Dothideomycetes （27.7%）and Anaerolineae （2.4%）? was sharply reduced to 2.5% and 0.007% when the saline-alkali concentration increased from 6‰ to 12‰; The Chao and Shannon indexes of the rhizosphere microbial community of giant juncao decreased with increasing saline-alkali concentration， and were significantly correlated with soil saline-alkali concentration? （P<0.01）. （2） The low concentration of saline-alkali stress had a positive effect on activities of urease， polyphenol oxidase and alkaline phosphatase in rhizophere soil of giant juncao， but activities of polyphenol oxidase， alkaline phosphatase and sucrase were inhibited when the saline-alkali concentration of soil exceeded 8‰; After planting giant juncao， the content of soil organic matter increased significantly （P<0.05） and the saline-alkali concentration were reduced significantly （P<0.05）; The neutralizing ability to soil alkalinity gradually weakened with the increasing saline-alkali concentration， and the neutralizing ability of soil salinity gradually weakened when the concentration exceeded to 8‰; When the saline-alkali concentration was 6‰， the production of giant juncao was the highest and the soil had higher contents of available nutrients and organic matter. The research indicates that growing giant juncao is beneficial to improving the fertility of saline-alkali soil by adjusting the enzyme concentration to better adapt to the medium and low concentration saline-alkali soil environment， and producing the corresponding dominant flora to adapt to the environment in different degrees of saline-alkali soil.

Key words： saline-alkali stress， soil microorganisms， physical and chemical properties， soil fertility， salt-tolerant plant

鹽堿地由鹽土和堿土組成，可溶性鹽濃度達0.6%及以上的土壤叫做鹽土，pH值超過9，交換性鈉離子濃度達到陽離子總代換量20%及以上的土壤叫做堿土（張鵬輝等，2017）。根據聯合國教科文組織及世界糧農組織的統計顯示，當前全球的鹽堿地主要分布在歐亞大陸、非洲和美洲西部，總面積約為9.54×108 hm2。我國的鹽堿地總面積已經多達9 913×104 hm2，分布于我國23個?。ㄗ灾螀^）和市，已經占據了我國國土總面積的10%（王景立等，2018），該現狀已嚴重威脅到我國的生態環境與糧食安全，研究出一種合適且具有生態效益的改良方法已迫在眉睫。

土壤根際微環境是土壤中的特殊微域之一，也是植物獲取養分的主要區域。在這塊區域里，植物、微生物、土壤相互作用（Ma et al.， 2015）。研究發現，土壤酶和微生物是土壤根際微環境中的活躍組分，對自然或人為因素造成的變化響應比較敏感（Xie et al.， 2007）。土壤酶包括微生物細胞和動植物殘體的胞內酶以及土壤溶液和吸附在土壤顆粒表面的酶（關松蔭等，1986）。土壤肥力、理化性質、植被和微生物種類與數量是影響土壤酶活性的主要因素。土壤鹽堿化可以改變土壤的一些理化性質，可直接影響微生物的生存（Mo et al.， 2016），也可間接影響土壤微生物的生境，使微生物的種群、數量和活性以及土壤酶活性等方面受到損害，導致土壤微生態失衡，從而影響作物生產（Chen et al.， 2004）。因此，研究土壤酶活性和微生物的影響因素對植物更好地生長具有重要意義。

菌草是指適合作為食用菌、藥用菌培養基并有綜合開發利用價值的草本植物（林占熺，2013）。1989年，菌草開始應用于生態改良，主要用于砒砂、崩崗和沙地的治理（林占熺等，2019）。彭露等（2014）利用菌草耐鹽堿的特性，將其作為改良和利用鹽堿土地的作物并進行了初步的研究，發現巨菌草能在鹽堿土地等生態脆弱地區種植并能快速成為優勢種，對當地土壤生態環境起到一定的改良作用。林興生等（2013a，b）、潘羿壅等（2018）初步研究了鹽堿脅迫對菌草生理指標的影響，篩選出了抗性較好的巨菌草（Pennisetum giganteum），同時發現巨菌草可以通過抗氧化酶的作用來降低氧化傷害，使植株維持正常的生理代謝。林占熺等（2015）通過對巨菌草在不同類型鹽堿土地的生物學特性研究，發現其在治理鹽堿地方面具有可行性，尤其是在砂化鹽堿地上，表現出生物量大且能很好地固定土壤的優點。利用該特點，巨菌草已廣泛應用于內蒙古阿拉善等地區，用以防風固沙和改良鹽堿土壤。然而，鹽堿對巨菌草根際土壤微生物多樣性及酶活性的影響還未見報道。本研究通過設置不同鹽堿梯度實驗，研究鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤微生物和酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗于2019年3—10月在福建農林大學（旗山校區）國家菌草工程技術研究中心育苗基地進行。選取抗鹽堿能力強的巨菌草為材料，進行土培盆栽實驗。每盆（高25 cm，直徑30 cm）裝取土壤4.5 kg，扦插2根巨菌草扦插桿，出苗后間苗到1株。該實驗基礎土壤為自然土，土壤理化性質：pH值7.42、含鹽量0.667 g·kg-1、堿解氮含量0.133 1 g·kg-1、速效磷含量0.335 3 g·kg-1。

1.2 方法

巨菌草生長1個月后進行鹽堿脅迫實驗。預實驗結果表明，當鹽堿濃度達到14‰時，巨菌草無法存活，因此，本實驗設置7個鹽堿脅迫梯度[土壤鹽堿濃度：0（CK）、2‰、4‰、6‰、8‰、10‰、12‰]，每個梯度設置三個重復。所用鹽堿成分為Na2CO3和NaHCO3，按照摩爾比1∶1混合。脅迫完成后全生育期充足供水。

鹽堿脅迫90 d后，取根際土壤2份，1份立即存于-80 ℃冰箱，用于測定土壤微生物多樣性，1份自然風干，用于測定土壤多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶活性和堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質含量。土壤酶活性參考嚴昶升（1988）和林先貴（2010）的方法測定;土壤養分參考魯如坤（2000）和鮑士旦（2000）的方法測定。

微生物多樣性測定采用Illumina高通量測序分析。采用福州麥力公司快速無毒通用 DNA提取試劑盒，分別提取真菌和細菌 DNA;利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，進行PCR擴增，在ITS1F_ITS2R和338F_806R測序區域合成帶有barcode的特異引物。PCR擴增步驟： 首先95 ℃預變性 2 min;然后98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共27個循環;最后延伸68 ℃ 10 min。接著進行熒光定量，參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，選擇符合測序要求的樣品，由美吉生物公司完成測序。按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。最后進行Miseq文庫的構建與測序。

1.3 數據處理

測定結果統計與分析采用Excel 2007軟件和SPSS 19.0軟件進行處理，土壤理化性質指標為平行樣均值±標準差，對各處理間各類指標的差異進行差異顯著性檢驗（P<0.05）以及Pearson相關性分析。

使用Usearch、Mothur軟件計算97%的相似度分類單位（operational taxonomic units，OTU）數量、高級信息OTU豐度、Alpha多樣性及聚類等（Paul et al.， 2004; Susan et al.， 2010）。

2 結果與分析

2.1 不同鹽堿脅迫下巨菌草根際土壤酶活性的變化

如圖1所示，隨著土壤鹽堿濃度的增加，巨菌草根際土壤多酚氧化酶活性呈先升高后降低趨勢（圖1：A），土壤鹽堿濃度在6‰～10‰時，顯著高于對照組（P<0.05）;根際土壤蔗糖酶活性呈逐漸降低趨勢（圖1：B），土壤鹽堿濃度在2‰～12‰時，顯著低于對照組（P<0.05）;根際土壤脲酶活性，隨鹽堿濃度呈逐漸升高趨勢（圖1：C），在6‰～12‰鹽堿濃度區間時，顯著高于對照組 （P<0.05）;根際土壤堿性磷酸酶活性，隨土壤鹽堿濃度的增加，呈先升高后降低趨勢（圖1：D），但在土壤鹽堿濃度超過6‰時，活性逐漸降低，且與對照組差異顯著（P<0.05）。

2.2 巨菌草根際土壤微生物對鹽堿脅迫的響應

2.2.1 鹽堿脅迫下巨菌草根際土壤微生物的多樣性指數分析 對巨菌草產量有顯著差異的處理（0‰、6‰和12‰）（圖2）進行微生物多樣性分析。如表1所示，各梯度間的真菌有效序列有顯著差異，與6‰相比，12‰的真菌有效序列減少了3.33%（P<0.05）; 進行OTU聚類后，真菌OTU數量在土壤鹽堿濃度為12‰ 時最低，比6‰和0‰分別減少了19.7%和27.2%。細菌有效序列在各處理間均有顯著差異，其中土壤鹽堿濃度為6‰時最高（P<0.05）;細菌OTU 數量在土壤鹽堿濃度為12‰時，與 6‰和0‰時相比，分別減少了20.7%和26.9%。

如表2所示，根際土壤中真菌和細菌的Chao指數和Ace指數均會隨著鹽堿濃度的升高而降低，且不同處理之間差異顯著，Shannon指數也隨鹽堿濃度的升高而降低。通過Chao指數和Ace指數可以看出，巨菌草的根際土壤真菌和細菌群落豐富度與OTUs變化基本一致。本研究中細菌、真菌的Simpson優勢度指數均值隨鹽堿濃度的升高而升高，但變化不顯著。

2.2.2 鹽堿脅迫下巨菌草根際土壤真菌群落組成分析 根據測序分類的結果，以物種至少在一個樣本中的相對豐度達到0.1%以上為標準，測得的真菌可以歸屬為4門8綱14目24科32屬。如圖3所示，根際土壤真菌在綱水平上的相對豐度差異情況如下：糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）和unclassified_p_Ascomycota的相對豐度在土壤鹽堿濃度為12‰時分別為68.5%、16.3%、8.1%，均高于其他兩種處理;座囊菌綱（Dothideomycetes）的相對豐度在土壤鹽堿濃度為12‰時，急劇減少，只有2.5%。

2.2.3 鹽堿脅迫下巨菌草根際土壤細菌群落組成分析 如圖4所示，土壤細菌在綱水平上的相對豐度差異情況如下：鹽堿濃度為12‰時，巨菌草根際土壤中，綠彎菌綱（Chloroflexia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）和δ-變形菌綱（δ-Proteobacteria）的相對豐度分別為8.5%、13.5%、5.6%和3.7%，均高于其他兩種土壤生境;α-變形菌綱（α-Proteobacteria）和γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）的相對豐度在土壤鹽堿濃度為6‰時，占比分別為23.03%和8.8%，大于土壤鹽堿濃度為12‰和0‰時的土壤生境;厭氧繩菌綱（Anaerolineae）的相對豐度隨土壤鹽堿濃度升高而減少，在12‰鹽堿土壤中僅有0.007%。

2.3 種植巨菌草前后土壤鹽堿及營養元素的變化

如表3所示，種植巨菌草后的土壤鹽堿度均有降低。種植巨菌草對土壤堿度的中和能力隨鹽堿濃度的升高逐漸減弱，對土壤鹽度的中和能力在中低鹽堿濃度隨鹽堿濃度的升高而升高，但濃度超過8‰時逐漸減弱。

如表4所示，種植巨菌草后土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量均顯著小于未種植巨菌草的土壤（P<0.05），且鹽堿濃度為6‰時的堿解氮、速效磷和速效鉀含量均顯著大于鹽堿濃度為12‰的土壤（P<0.05）。土壤有機質含量隨鹽堿濃度的升高顯著減少（P<0.05）。種植巨菌草后的土壤有機質含量顯著高于未種植巨菌草的土壤（P<0.05）。

3 討論與結論

3.1 鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤酶活性的影響

土壤酶在土壤環境中通過不同微生物類群生理代謝產生（Baldrian， 2009），是反映土壤肥力的重要指標（Petric et al.， 2011; You et al.， 2014）。土壤酶活性的變化反映了土壤微生物對環境改變的響應機制（Cusack et al.， 2011）。土壤多酚氧化酶是抗氧化酶的一種，本研究中，在鹽堿濃度為6‰～10‰時，顯著升高68.5%～122.4%（P<0.05）。潘羿壅等（2018）發現植物通過抗氧化酶作用降低氧化傷害，維持其正常生理代謝，本研究巨菌草在中低程度鹽堿土壤中，多酚氧化酶濃度較高，說明巨菌草可以較好地適應鹽堿環境。蔗糖酶可以將碳水化合物水解成微生物繁殖所需要的養分，其活性可以用來表征土壤生物學活性，作為評價土壤熟化程度的指標（耿玉清和王冬梅，2010）。陳孔飛等（2020）研究發現沙棗林土壤中蔗糖酶活性隨鹽堿濃度升高而降低，與本文研究結果蔗糖酶在2‰～12‰鹽堿濃度時顯著降低6.9%～77.8%（P<0.05）相一致，說明巨菌草根際土壤微生物活性隨鹽堿濃度的升高顯著降低。脲酶在土壤中很活躍，直接參與到土壤中有機氮的轉化過程中，土壤中脲酶活性的提高有助于將有機氮轉化為可被植物直接利用的有效氮（薛冬等，2005）。顏路明和郭詳泉（2017）研究發現，經過鹽堿處理的香樟幼苗根際土壤中的脲酶活性，在一定濃度的鹽堿脅迫下有升高趨勢，與本研究結果基本一致，說明巨菌草在中高濃度鹽堿土壤環境中仍有較強的氮素轉化能力，對鹽堿土壤環境有較好的適應性。土壤磷酸酶活性有酸性、中性和堿性3種（Frankenberger et al.， 1983），其活性大小影響土壤中有機磷的循環速度且活性易受pH影響（王涵等，2008）。本研究中，堿性磷酸酶在鹽堿濃度為2‰～10‰時，顯著升高15.0%～68.9% （P<0.05）。劉磊（2017）研究發現，兩種甜菜根際土壤的堿性磷酸酶隨處理水平的增加呈“中-高-低”的趨勢，與本研究結果一致，這充分印證了巨菌草在中低濃度鹽堿環境中能較好生長。也有不同觀點，如楊曉娟等（2013）和唐健等（2016）的研究表明，林地土壤的磷酸酶與pH值正相關，其原因可能是土壤酶活性受到林齡的影響顯著，受pH的影響不大。綜上所述，本研究發現，中度鹽堿脅迫對巨菌草的根際土壤脲酶、多酚氧化酶、堿性磷酸酶活性有促進作用，而當土壤鹽堿濃度超過8‰時，巨菌草的根際土壤多酚氧化酶、堿性磷酸酶和蔗糖酶會受到抑制，這說明巨菌草在中低鹽堿土壤中，能較好地維持正常生理代謝。

3.2 鹽堿脅迫對巨菌草根際土壤微生物的影響

Lauber等（2009）認為鹽堿程度是影響土壤微生物群落結構的主要因素之一。在極端鹽堿土壤中，分布著大量的喜鹽堿菌類，而非耐鹽堿菌類則不占有優勢（石偉，2011;李新，2015;李新等，2016）。在不同程度鹽堿土壤中，耐鹽堿的菌株為主要組分，本研究詳細描述了巨菌草根際土壤真菌、細菌在綱水平上的表現。在真菌群落內，綱水平下的糞殼菌綱、散囊菌綱和unclassified_P_Ascomycota，均與土壤鹽堿濃度正相關，逐漸成為優勢菌群;綱水平下的座囊菌綱相對豐度均與土壤鹽堿濃度負相關，逐漸成為劣勢菌群。在細菌群落內，綱水平下的綠彎菌綱、擬桿菌綱、芽單胞菌綱和δ-變形菌綱豐度隨土壤鹽堿濃度升高而提高，逐漸成為優勢菌群，其耐鹽堿性比其他菌群更強;綱水平下的放線菌綱和γ-變形菌綱豐度，均隨土壤鹽堿濃度增加而減少，逐漸成為劣勢菌群，以上結論與李新（2015）在不同程度鹽堿脅迫的條件下得到的土壤微生物優勢菌群高度一致。

結合巨菌草地上部產量，分析根際土壤微生物群落結構發現，真菌、細菌的有效序列數與巨菌草的產量正相關（P<0.05），真菌OTUs和細菌OTUs與土壤鹽堿濃度負相關（P<0.01）。根際土壤微生物Chao指數、Ace指數、Shannon指數均會隨鹽堿濃度升高而降低，表明土壤鹽堿濃度越高，其根際土壤中的細菌類群越少，與前人研究結果基本一致（Karen & Pamela， 2006）。范俊崗等（1995）的研究還證實，根系分泌物中含有助于植物生長的植物生長素及氨基酸，可促進產量的提高，由此推測微生物結構發生變化，也可能是受植物根系分泌物的影響，根系分泌物為根際土壤微生物系統提供所需要的碳源和能源等充足的營養條件，還影響著根際微生物的多樣性（田晴等，2020）。本研究中，座囊菌綱在鹽堿濃度6‰時為優勢菌綱，而在12‰鹽堿濃度時數量減少，可能為巨菌草的促生菌類，這與葉文雨等（2020）的研究長勢良好的巨菌草根際土壤優勢菌綱為座囊菌綱等相一致，說明巨菌草根際土壤微生物群落數量會隨鹽堿濃度升高而減少，但是會出現相應的優勢菌群來維持土壤微環境的平衡。

3.3 種植巨菌草對土壤鹽堿濃度及營養元素的影響

土壤pH值是反應土壤酸堿化程度的主要指標，也是影響土壤肥力的重要因素之一（陳苗苗，2017）。種植巨菌草后的土壤pH值減小，可解釋為植物死去的根葉在腐解過程中，形成大量的有機酸類加上植物根系分泌的有機酸，對堿性鹽類起到了中和作用（涂書新等，2000）。減小幅度隨著土壤鹽堿梯度的升高而逐漸降低， 說明巨菌草對高濃度鹽堿脅迫的調節能力較為一般，吳振振等（2016）研究發現，鹽堿土壤的pH隨甘草種植時間的增加呈下降趨勢， 與本研究結果一致。導致土壤理化性質惡化的一個重要原因是土壤鹽分濃度過高，土壤鹽分的變化情況是衡量鹽土改良效果的關鍵指標（陳琴，2012）。本研究中，各個鹽堿梯度的土壤種植巨菌草后，含鹽量均有一定程度減小，這可能是因為巨菌草生長發育需從土壤中吸收一定的鹽分。李瑞利（2010）研究發現，種植五種耐鹽植物后，土壤含鹽量明顯下降，尤其是在表層的根系層，這與本研究結果保持一致。土壤含鹽量減小幅度隨土壤鹽堿梯度的升高呈先升高后降低趨勢，這說明一定程度的含鹽量可能會促進巨菌草生長發育及對土壤鹽分的吸收，但在土壤含鹽量過高時，巨菌草生長發育受到抑制，對土壤鹽度的改善能力也隨之減弱。種植巨菌草后，鹽堿土壤中的堿解氮、速效磷和速效鉀含量均顯著小于未種植土壤，說明巨菌草能在鹽堿環境中較好地吸收土壤中的速效養分，維持正常生長，從而適應該鹽堿土壤環境。

綜上所述，巨菌草能通過調節酶的濃度來適應中低濃度鹽堿環境，且在不同程度的鹽堿土壤中，產生相應的優勢菌群來適應該環境。種植巨菌草對中低濃度鹽堿土壤有一定改良作用，顯著提高了土壤有機質含量，且pH值和含鹽量會有一定程度減小，其改良能力隨鹽堿濃度的升高逐漸減弱。

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（責任編輯 周翠鳴）

收稿日期：2021-04-21

基金項目：國家自然科學基金（31500265）;福建農林大學科技創新專項基金（CXZX2017566， CXZX2019140G） [Supported by National Natural Science Foundation of China （31500265）; Special Fund for Science and Technology Innovation of Fujian Agriculture and Forestry University （CXZX2017566， CXZX2019140G）]。

第一作者： 嚴少娟（1994-），碩士研究生，研究方向為環境生物學，（Email）shaojuan3446@163.com。

通信作者：孫紅英，博士，助理研究員，研究方向為環境生態學，（Email）shy198319@126.com。