不同香型白酒對斑馬魚醉酒行為的影響

陳欣怡，丁子元，劉永泉，余枚珠，夏 冰，鄭曉衛，*

（1.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南 湘西土家族苗族自治州 416000）

白酒具有社交產品的本質屬性，一直以來承載了人們的情感交流和文化傳承[1]。中國是白酒的生產和消費大國，白酒對人體健康的作用說法不一[2]。飲酒不當會引發社會問題，也會導致過早死亡和多種疾病等危險[3]。隨著社會老齡化和人們健康意識的不斷提高，人們對于白酒的消費逐漸從感性走向了理性[4]。人們對飲酒滿足美好的精神享受的同時，對于白酒的飲用舒適度有了更高的要求[5]。飲用舒適度作為飲酒后人體最直接的體驗表現，反映了酒品質的好壞[6]。越來越多的白酒生產企業開始關注飲后感，尤其是酒類消費市場已經由飲酒到舒適飲酒進行深度轉變[7]。

飲前及飲中的飲用舒適度的評價主觀性較強，個體差異對兩者影響較大。而對飲后舒適度的評價，因飲用者會產生一系列生理反應，評價指標相對客觀[8]。造成飲后不適感的原因相當復雜，除了飲酒人的身體狀況、飲用量、飲酒習慣、思維情緒及環境因素等以外，還有酒體本身設計和質量的因素，主要包括醛類、醇類物質等[9]。目前，雖然對于影響白酒飲用舒適度的確切作用機制尚不明確，但一般認為是多種因素共同作用產生的綜合結果[10]。近年來，隨著生命科學研究手段的不斷發展，越來越多行業內學者通過建立動物模型評價體系，來直觀評價飲后感[8]。張夢妍等[11]根據醉酒昏睡期小鼠的醉酒時間、醒酒時間建立了白酒飲用舒適度評價模型。格絨澤仁等[12]通過小鼠曠場實驗結合高級醇類物質定量分析，建立了針對濃香型白酒飲后不適感的關鍵高級醇類物質關聯性判定方法。越來越多的研究認為酒體特征組分的整體協調性對醉度產生較大影響，合適的雜醇、酸、酯比例可有效降低醉度[13]。目前較多研究利用小鼠進行白酒相關試驗，但規模小，人工操作也較復雜，成本較高。斑馬魚1994年起被正式確定為一種新型的模式生物，被認為是一種適合神經化學和行為研究的脊椎動物，它體型小、繁殖速度快、成本低、易于操作且實驗周期短[14]。目前，斑馬魚已經成為最受學者重視的脊椎動物模式生物之一，在很多學科上的應用也顯示出了很大的潛力[15]。在酒的研究領域中，斑馬魚模型在葡萄酒研究中已被應用，錢星文等[16]建立斑馬魚興奮期醉酒模型，評價藥食同源健康產品益甘舒對斑馬魚的解酒作用。國外也有報道通過評估斑馬魚焦慮樣行為、運動以及大腦中的氧化損傷，研究N-乙酰半胱氨酸對急性乙醇暴露斑馬魚的影響，以期評估防止酒精宿醉的藥物[17]。但斑馬魚模型尚無在白酒方面的應用。

視頻追蹤已經成為研究斑馬魚行為的標準流程，通過視頻記錄其運動過程，并提取運動軌跡和運動特征，如速度、路程等，并對這些參數進行分析來進行生物學研究[18]。本研究針對10款市售的4種香型的白酒，通過建立斑馬魚醉酒模型，通過視頻追蹤分析比較斑馬魚暴露于不同白酒1 h和2.5 h后運動的行為參數比。同時結合白酒高級醇和醛類物質的定量分析，建立了引起飲后感差異判定的新方法，確定馥郁香型白酒飲后感快速評價體系。為進一步提高酒類品質，提高飲用舒適度提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣均選用知名品牌白酒，兩款醬香型白酒A、B，三款濃香型白酒C、D、E，兩款清香型白酒F、G，三款馥郁香型白酒H、I、J，食用酒精（酒精度均為52%vol）：市售；受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚（飼養于杭州環特生物科技股份有限公司養魚中心（SYXK（浙）2012-0171），養魚用水溫度為28 ℃（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg市售的速溶海鹽，電導率為450～550 μS/cm；pH值為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3），飼養管理符合國際AAALAC認證，認證編號為001458）：杭州環特生物科技股份有限公司。

仲丁醇、正丙醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、乙醛、正丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、糠醛、苯甲醛標準品（均為色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SZX7解剖顯微鏡：日本OLYMPUS公司；VertA1型CCD相機：上海土森視覺科技有限公司；V3.11行為分析儀：法國ViewPoint Life Sciences公司；6孔板、96孔板：無錫耐思生命科技股份有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器）（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、CP-WAX57CB色譜柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美國Agilent 公司；ME204分析天平（感量為0.1 mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

隨機選取5 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。實驗組分別水溶給予2%濃度的酒樣A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，對照組1為與酒樣同濃度的優級食用酒精，同時設置對照組2為正常養殖水，每孔容量為3 mL。28 ℃分別處理1 h和2.5 h后，將酒樣移除，隨機選取10尾斑馬魚利用斑馬魚行為分析儀監測斑馬魚的20 min內運動速度、總運動距離和運動軌跡，并評價酒樣對斑馬魚運動功能的影響。

1.3.2 酒體風味成分檢測方法

準確吸取待測白酒樣品5 mL，加0.1 mL內標溶液（2%），混勻，經0.45 μm的有機濾膜過濾后供氣相色譜儀測定[19]。醇、醛類物質測定采用氣相色譜法，其色譜條件如下：色譜柱溫度：初溫35 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min升至70 ℃，然后以3.5 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至210 ℃，保持5～15 min；檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氮氣（N2）（純度99.999 9%），流量1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；分流比20∶1。采用內標法，內標物選用2%叔戊醇、2%乙酸正戊酯、2%2-乙基丁酸。

1.3.3 行為參數比的測定

由行為參數計算行為參數比，可以減少實驗動物自身原因造成的誤差[20]。若行為參數比越接近于1，被認為酒對行為情緒的影響越小，該研究中行為參數比以平均速率比表示[21]。

平均速率比=暴露酒樣后斑馬魚運動的行為參數/未暴露酒樣斑馬魚運動的行為參數。

1.3.4 統計學分析方法

采用SPSS 24.0軟件進行數據的統計分析，使用單因素ANOVA方法進行統計，結果采用“平均值±標準差”（）表示。利用主成分分析法（principal component analysis，PCA）降維的思想，將多個變量轉化成為少數的幾個綜合的變量進行分析，并使用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚行為學實驗結果

2.1.1 運動行為學指標測定結果

本研究前期的研究成果表明，斑馬魚對2%的53%vol酒樣的耐受性較好。斑馬魚分別暴露于酒樣1.0 h和2.5 h后轉移至正常養殖水觀察1.0 h，發現在前20 min內，各酒樣對其飲后行為的影響最大。因此，本實驗對停止暴露酒樣后20 min內的斑馬魚行為數據進行統計，結果見表1。

表1 各處理組斑馬魚運動行為學指標Table 1 Behaviors of zebrafish in different treatment group

由表1可知，斑馬魚暴露于酒樣A、B 1.0 h與對照組2有顯著性差異（P＜0.05），而暴露于酒樣A組2.5 h與對照組2間無顯著性差異（P＞0.05），暴露于酒樣B 2.5 h與對照組2有極顯著差異（P＜0.01）。斑馬魚暴露于酒樣C、D、E 1.0 h和2.5 h均與對照組2有極顯著性差異（P＜0.01）。無論斑馬魚暴露酒樣1.0 h或2.5 h，酒樣F組、食用酒精對照組1和正常養殖水對照組2間無顯著性差異（P＞0.05），表明可以消除乙醇對引起飲后不適的關鍵物質的干擾，該結果與格絨澤仁等[12]的研究結果相似。而暴露于酒樣酒樣F組2.5 h與對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。斑馬魚暴露于酒樣G 1.0 h和2.5 h均與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。其他酒樣H、I、J彼此間無顯著性差異（P＞0.05），但均與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。以上結果發現同一種香型酒樣具有相似的趨勢，相同品牌下不同品類的酒樣H、I、J差異不大，這可能與生產工藝有關。

2.1.2 斑馬魚行為參數比

由行為參數計算行為參數比，可以減少實驗動物自身原因造成的誤差[21]。若行為參數比越接近于1，被認為酒對行為情緒的影響越小，斑馬魚飲后行為恢復正常并與未飲酒斑馬魚感受相當，認為斑馬魚醒酒，該行為參數比與1的差值的絕對值為行為偏離度，行為偏離度越小，飲后感的舒適性越高[22]。斑馬魚暴露酒樣不同時間后20 min內的平均速率比測定結果見圖1。

由圖1（a）可知，斑馬魚暴露于酒樣A1.0 h后，平均速率比在前20 min內酒樣A組與對照組1有極顯著差異（P＜0.01），第20 min時酒樣A組與對照組1無顯著性差異（P＞0.05），酒樣A組平均速率比接近1，處于醒酒狀態。15 min時酒樣B組與對照組1無顯著性差異（P＞0.05），酒樣B組斑馬魚醒酒時間超過20 min。斑馬魚暴露于酒樣C、D 和E 1.0 h后，平均速率比顯著低于對照組1（P＜0.01），醒酒時間超過20 min。其中酒樣D組斑馬魚平均速率比顯著低于其他各組（P＜0.01），表明受抑制情況顯著高于其他各組（P＜0.05）。酒樣F組和對照組1在10～20 min時無顯著性差異（P＞0.05），酒樣F組平均速率比在1左右，處于醒酒狀態。酒樣G組的平均速率比小于1，與對照組1有顯著性差異（P＜0.05），醒酒時間超過20 min。酒樣H、I、J組斑馬魚的平均速率比均小于1且顯著低于對照組1（P＜0.01）。前5 min內與酒樣A和B組無顯著性差異（P＞0.05），10～20 min與酒樣C和E組無顯著性差異（P＞0.05），有下降再升高的趨勢，醒酒時間超過20 min。說明暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚在醒酒過程前期與暴露于醬香型白酒后的飲后感相當，在醒酒過程的后期與暴露于濃香型白酒后的飲后感相當。

圖1 暴露酒樣后20 min內斑馬魚的平均速率比Fig.1 The average rate ratio of zebrafish within 20 min after exposure of liquor

由圖1（b）可知，斑馬魚暴露于酒樣2.5 h后，前10 min內所有酒樣組斑馬魚的平均速率比均低于1，之后有逐漸上升趨勢。在10～20 min內，酒樣A和G組斑馬魚平均速率比接近于1，與對照組1差異顯著（P＜0.05）。酒樣F組與對照組1斑馬魚的平均速率比上升至1以上且兩者間無顯著性差異（P＞0.05）。酒樣A、F、G、H、J組與對照組1在20 min時斑馬魚平均速率比接近于1，而酒樣B、C、D、E、I組斑馬魚平均速率比在0.6左右，醒酒時間相對更長。說明隨著暴露酒樣時間延長，馥郁香型白酒H、J與醬香型白酒A和清香型白酒F、G醒酒時間相當，酒樣H、J醒酒較快。

2.2 十款白酒高級醇類、醛類物質成分的定量分析

高級醇含量不合理是影響酒體醉酒程度的常見原因之一，高級醇含量過高，會抑制神經遞質的表達，飲酒者次日醒來會出現頭暈、頭痛癥狀[21-23]。此外，過量的醛類物質飲后也可造成頭痛，降低飲用舒適度[9]。所以本研究主要以高級醇類、醛類物質為研究對象。通過GC-FID檢測A、B、C、D、E、F、H、G、I、J十款白酒的高級醇類及醛類物質含量，結果見表2。

由表2可知，共檢出13種高級醇類物質及7種醛類物質。酒樣A、B中高級醇類和醛類物質總含量較高，酒樣A中丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、異丁醛、苯甲醛和糠醛含量相對較高。酒樣B中正丙醇、乙醛、正丙醛、乙縮醛含量較高。酒樣D中2-戊醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、異戊醛含量較高。酒樣G中異丁醇、活性戊醇、異戊醇、β-苯乙醇含量較高。酒樣J中仲丁醇含量較高。酒樣E和F高級醇類和醛類物質含量均相對較低，酒樣C、H、I、J高級醇類和醛類物質含量居中。

2.3 主成分分析結果

2.3.1 高級醇類物質主成分分析

對十款不同香型、品牌的白酒檢測的高級醇類物質進行主成分分析，通過主要主成分方差百分比和累積方差貢獻率分析可知，前3個主成分特征根大于0.1，且累計方差貢獻率達到86.8%，因此選擇前3個成分因子作為主成分因子。由因子負荷矩陣可知，異丁醇、活性戊醇、異戊醇在主成分1上有較大載荷，正丁醇、正己醇、正戊醇在主成分2上有較大載荷，糠醇在主成分3上有較大載荷。將上述PCA結果進行投影，投影圖見圖2。

圖2 高級醇類物質主成分分析投影圖Fig.2 Projection plot of principal component analysis for higher alcohols

由圖2可知，各個酒樣中3個主成分的權重各不相同，表明不同香型、品牌的酒樣中不同主成分所代表的高級醇類物質的貢獻度不同。酒樣A、B和C中主成分3所占權重最大，表明主成分3所代表的糠醇在其所含的高級醇類物質中起主要作用，且在酒樣A中的作用程度大于酒樣B和C。酒樣D、E、J中主成分2所占權重最大，表明主成分2所代表的正丁醇、正戊醇、正己醇在其所含的高級醇類物質中起主要作用，且在酒樣E中的作用程度更顯著。酒樣F和G中主成分1所占權重最大，表明主成分1所代表的異丁醇、活性戊醇、異戊醇在其所含的高級醇類物質中起主要作用。酒樣H和I中3個主成分均不起主要作用。

2.3.2 醛類物質主成分分析

以醛類物質作為指標進行分析，通過主要主成分方差百分比和累積方差貢獻率發現前3個主成分特征根大于0.1，且累計方差貢獻率達到92.5%，因此選擇前三個成分因子作為主成分因子。由因子負荷矩陣可知，異戊醛、乙醛在主成分1上有較大載荷，苯甲醛、糠醛在主成分2上有較大載荷，苯甲醛在主成分3上有較大載荷。將上述PCA結果進行投影，投影圖如圖3。

圖3 醛類物質主成分分析投影圖Fig.3 Projection plot of principal component analysis for aldehydes

由圖3可知，各個酒樣中3個主成分的權重各不相同，表明不同香型、品牌的酒樣中不同主成分所代表的醛類物質的貢獻度不同。酒樣A、B中主成分2所占權重最大，表明主成分2所代表的苯甲醛、糠醛在其所含的醛類物質中起主要作用。酒樣C、D、G中主成分3所占權重最大，表明主成分3所代表的苯甲醛在其所含的醛類物質中起主要作用。酒樣E、F、H、I、J 中主成分1所占權重最大，表明主成分1所代表的異戊醛和乙醛在其所含的醛類物質中起主要作用，且在酒樣I中的作用程度更大。

從酒樣中高級醇類及醛類物質作為指標進行主成分分析發現，酒樣A、B和C中起主要作用的高級醇是糠醇。酒樣D、E、J中起主要作用的高級醇是正丁醇、正戊醇、正己醇。酒樣F和G中起主要作用的高級醇是異丁醇、活性戊醇、異戊醇。苯甲醛是酒樣A、B、C、D和G中起主要作用的醛類物質，此外酒樣A和B中起主要作用的醛類還包括糠醛。酒樣E、F、H、I、J 中起主要作用的醛類是異戊醛和乙醛。

3 討論

本研究結合斑馬魚行為學實驗和酒樣高級醇、醛類物質主成分分析，對能引起不同香型、品牌白酒飲后不適的關鍵物質進行初步判定。研究中通過利用斑馬魚行為學實驗，根據飲后20 min內的平均行為偏離度發現，暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚在醒酒過程前期與醬香型白酒飲后感相當，在醒酒過程的后期與濃香型白酒飲后感相當，其中濃香型白酒酒樣D為引起斑馬魚飲后不適感最強的酒樣。從酒樣中高級醇類和醛類物質主成分分析結果來看，酒樣D中起主要作用的高級醇是正丁醇、正戊醇、正己醇，且發現酒樣D在所有酒樣中這三種物質含量最高。結合行為學實驗和高級醇物質含量檢測結果，初步推測正丁醇、正戊醇、正己醇為引起酒樣D飲后不適的關鍵高級醇，三種物質的高含量導致了飲后不適感較強。格絨澤仁等[12]進行了濃香型白酒不同品牌酒樣中高級醇類物質主成分分析，發現其中以正丁醇、正戊醇、正己醇為關鍵高級醇的酒樣飲后不適感弱于以異戊醇、異丁醇和2-戊醇為關鍵高級醇的酒樣，認為異戊醇為引起濃香型白酒飲后不適的關鍵高級醇之一。該結果與本研究結果有所不同，推測原因可能是本實驗涉及不同香型、不同品牌的白酒，釀造工藝不盡相同，樣品特征差異范圍較大。

此外，斑馬魚實驗中對比了不同暴露時間下的酒樣飲后感差異，發現酒樣A在暴露時間從1.0 h延長至2.5 h后，行為偏離度反而減小，飲后舒適度增強。結合高級醇物質和醛類物質含量檢測結果，發現酒樣A中正丙醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、苯甲醛和糠醛等部分醇類和醛類物質含量相對較高，但是酒樣A整體舒適度卻較高，可能與酸、酯比例有效降低上述物質產生的負影響有關。由于白酒是一個復雜的體系，引起飲后不適的關鍵物質可能是綜合作用的結果，研究涉及的酒樣有限，關于白酒飲后舒適度未來還需更深入的探究。此外，盡管學術界的成熟的視頻追蹤算法在斑馬魚成魚上取得了較好的效果，但由于幼魚的尺寸小、個體特征不明顯、交叉情況嚴重、運動不連續的特點，市場上商業的視頻追蹤軟件對幼魚的追蹤效果并不完美，未來需要更深入的研究助力相關領域的探索[24-25]。

4 結論

本研究利用斑馬魚試驗對比了不同香型、品牌的白酒飲后舒適度，從平均行為偏離度角度分析，發現同一香型的酒樣飲后感相似，馥郁香型白酒的飲后舒適度前期與醬香型白酒相近，后期與濃香型白酒相近。隨著暴露酒樣時間延長，暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚與暴露于醬香型和清香型白酒斑馬魚的醒酒時間更接近。初步認為這與馥郁香型白酒兼具濃、清、醬香三種特征有一定關系。此外，初步判定正丁醇、正戊醇和正己醇為引起不同香型白酒飲后不適的關鍵高級醇。本研究為進一步深入探究白酒飲后感及其質量控制體系奠定基礎。