核盤菌Ss160的基因克隆與功能初探

吳姍，左蓉，李艷，趙傳紀，董志雪，劉杰，何貽洲，吳鈺坡，高峰，白澤濤*，劉勝毅，陳建國

（1.中國農業科學院油料作物研究所，農業農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢，430062；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢，430062）

由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的真菌性病害-菌核病可侵染600多種植物，包括幾乎所有的雙子葉植物和一些單子葉植物。核盤菌侵染初期在寄主植物組織中形成棉花狀菌絲，附著于植物健康組織體表上，導致植物組織腐爛，進而壞死，其菌絲形成的菌核能夠在土壤中存活8 年以上，當周圍溫度為15～25℃時可以再次侵染地上植物[1～3]，給我國的農作物造成了巨大經濟損失[4～6]。油菜作為我國重要的油料作物，常年受菌核病危害，據統計菌核病造成的油菜產量損失通常在10%～20%之間，并且菌核病病害程度愈發嚴重，部分產區產量損失高達80%[7,8]。因此，目前迫切需要挖掘菌核病抗性基因，解析核盤菌-植物作用機理，進而培育菌核病抗病品種，提高植物對菌核病的防控能力和水平。

植物應對病原菌的先天免疫反應有兩種模式，分別為模式識別受體誘導的免疫反應（PTI）和效應蛋白誘導的免疫反應（ETI）[9]。PTI 反應是植物細胞膜上的模式識別受體蛋白（PRRs）對病原相關分子模式（PAMPs）的識別，通過胞內的級聯將信號在植物體內擴大和傳遞，ETI 是植物抗病基因（resistant gene）特異性識別病原菌效應蛋白而觸發產生的新一輪免疫反應，ETI 相對于PTI 而言，免疫反應更加迅速和強烈，往往伴隨著超敏反應來限制病原菌的入侵[10,11]。效應蛋白是由病原菌分泌的，這些效應物通常是小而獨特的蛋白質，能夠通過改造植物體內的細胞結構、代謝途徑等方式擊敗PTI，從而利于病原菌侵染寄主植物[12]。近年來通過篩選病原菌效應蛋白在植物中的互作靶標取得了很好的進展，研究發現某些病原菌能夠與植物14-3-3 蛋白相互作用，如蚜蟲唾液分泌蛋白M10 及其同源物Ag10K 可以與番茄14-3-3蛋白TFT7相互作用從而介導番茄抵抗蚜蟲的能力[13]。由此可見，從病原菌效應蛋白入手，挖掘其在寄主植物中的互作因子，解析病原菌-植物互作機制，能夠為未來通過基因工程改造基因提高植物抗病水平提供一種現實可行的策略。

由于核盤菌為非專性寄生型真菌，寄主范圍廣且侵染復雜，所以核盤菌-油菜的互作機制目前仍然不清楚。但隨著研究的深入，研究者鑒定到部分核盤菌分泌蛋白能夠對植物產生毒性，包括SsSSVP1，SsCP1，SsSm1，以及Ss-Caf1 等，其中Ss-CP1能夠與油菜的PR1蛋白在質體外相互作用利于核盤菌的侵染[14]。研究者基于三代測序技術重新測序組裝完成的核盤菌基因組鑒定到70 個可能效應蛋白[15]，但是這些效應蛋白在核盤菌-植物互作中具有怎樣的功能，目前缺乏深入研究。本研究基于實驗室核盤菌接種油菜葉片的不同時間點收集到的菌絲轉錄組數據鑒定到一個核盤菌基因Ss160（Sscle04g035160）在菌-植物互作中誘導表達，并且該基因為上述預測的效應蛋白之一，因此，本研究將以此基因為研究點，通過生物信息分析以及分子實驗對其功能進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草種子為本實驗室保存。核盤菌（S.sclerotiorum）WH13 為本實驗室保存。酵母雙雜交實驗所用的酵母菌株AH109 為本實驗室保存。亞細胞定位表達載體p2300-GFP、酵母雙雜交陽性對照載體pGBKT7-p53+pGADT7-T，酵母雙雜交陰性對照載體pGBKT7-Lam+pGADT7-T 均由本實驗室改造并保存。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 購自深圳康體生命科技有限公司，農桿菌GV3101 購自武漢轉導生物實驗室有限公司。

2×Phanta Max Master Mix、同源重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、限制性內切酶BamH1、EcoR1 及DL2000 Marker 購自TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質?；厥赵噭┖匈徸陨虾Ｌ旄锕こ逃邢薰?；YPDA、YPD培養基購自青島高科工業園海博生物技術有限公司；選擇性缺陷培養基（SD/-Trp-Leu、SD/-His-Trp-Leu-Ade）購自Clontech 公司；AbA 購自solarbio 公司；X-α-Gal 購自INALCO 公司；Yeast extract、Tryptone 購自Thermo 公司；NaCl、DMSO、MgCl2·6H2O 購自國藥集團化學試劑有限公司；鮭魚精購自solarbio公司，乙酰丁香酮購自Acmec公司。

1.2 方法

1.2.1 核盤菌Ss160基因的克隆和表達模式 為收集核盤菌菌絲，在鋪有玻璃紙（高溫滅菌）的PDA固體培養基上接種活化的核盤菌菌絲塊，黑暗培養。當菌絲長滿平板后，將菌絲刮下置于液氮中研磨成粉，并利用Trizol 法提取核盤菌RNA，用超微量分光光度計NanoDrop 2000 檢測RNA 質量和濃度，之后根據TaKaRa 公司反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA鏈，獲得的核盤菌cDNA作為后續基因擴增的模板。

Ss160基因引物是根據核盤菌基因組中公布的CDS 序列設計的（表1），酵母載體引物和亞細胞定位引物5’和3’端分別加入同源重組序列和酶切位點。以核盤菌WH13 cDNA 為模板，按照2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)使用說明準備50μL 擴增體系：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，正向反向引物分別2μL，cDNA 4μL，ddH2O 17μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1min ，34 個循環；72℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，根據回收試劑盒說明書對Ss160進行切膠回收。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers for the experiment

1.2.2 核盤菌Ss160生物信息學分析 將克隆得到的Ss160核盤菌基因與基因組對應基因序列進行比對分析以確定獲得的基因是本研究的目的基因。進一步通過生物信息學方法對該基因的序列特征進行分析，包括理化性質[16]、信號肽[17]和蛋白結構[18]等。利用NCBI 數據庫對Ss160的同源基因進行搜索，并利用MEGA5.2 軟件[19]對不同物種中Ss160的同源基因序列進行序列比對和進化樹構建，以明確Ss160的親緣關系，其中序列比對的展示利用GENEDOC 軟件（https://genedoc. software. informer.com/download/）完成。

1.2.3 Ss160 的亞細胞定位 為初步探索Ss160的定位，本研究進一步利用同源重組法構建了亞細胞定位載體，將克隆到的Ss160與p2300-GFP 載體進行連接，體系為：6μL p2300-GFP 線性載體（KpnI 和BamH I 酶切回收獲得）、3μLSs160回收產物、1μL Exnase Ⅱ、3 μL 5×CE ⅡBuffer、補ddH2O 至15 μL。之后37℃恒溫孵育器孵育30 min 以上。連接產物通過熱激法轉化大腸桿菌，在超凈工作臺中挑單克隆，通過菌液PCR 法鑒定陽性單克隆，送測序。測序正確的活化菌液與50%甘油1:1 混勻，于-80℃冰箱保存。同時將該菌液擴大培養用于質粒的提取，質粒通過凍融法轉化農桿菌GV3101：-80℃冰箱中取出農桿菌感受態細胞GV3101，凍融后，分別加入10μL 連有Ss160的重組質粒以及空載對照質粒，吹打混勻；液氮中冷凍5 min，37℃恒溫水浴鍋水浴5 min；超凈臺內加入新鮮的無抗生素液體LB 培養基500μL，28℃條件下220 r/min 活化2 h；取100μL 菌液均勻涂抹到LB（含50μg/mL Kan 和50μg/mL Rif）平板，28℃條件下倒置培養2 d，挑單菌落進行菌液PCR 鑒定陽性單克隆。將鑒定為陽性的克隆菌液按1:1 比例加入50%甘油保菌，-80℃冰箱保存備用，并命名為35S::Ss160-GFP和p2300-GFP。

將構建好的亞細胞定位表達載體35S::Ss160-GFP農桿菌菌液接種10μL至10 mL的LB液體培養基（含50 μg/mL Kan 和50 μg/mL Rif），28℃條件下220 r/min 過夜活化。之后取20 μL 活化菌液到20 mL 的LB（含50 μg/mL Kan 和50 μg/mL Rif）液體培養基中擴大培養。離心收集菌體并加入MES 液體培養基懸浮菌體，黑暗靜置2 h，然后用注射器將菌液注射到4～5 周煙草葉片的下表皮，溫室條件下黑暗培養12 h，光照培養36 h，用激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1）觀察GFP 熒光蛋白在細胞中的表達部位。

1.2.4 瞬時表達Ss160煙草葉片菌核病抗病鑒定將分別含有35S::Ss160-GFP以及空載體對照p2300-GFP質粒的農桿菌菌液注射到4～5周煙草葉片（分別注射20～30 個葉片）下表皮，黑暗培養48 h后在接種室對轉化了35S::Ss160-GFP和p2300-GFP的葉片以及野生型煙草葉片進行核盤菌離體接種。具體接種方法為：首先將新鮮核盤菌菌絲塊接種在PDA 固體培養基，24 ℃條件下黑暗培養至菌絲生長至平板2/3 處時，用打孔器在菌絲邊緣打孔（8 mm×8 mm），得到的菌絲塊菌絲朝下接種到離體煙草葉片上。接種完成后的煙草葉片放在封閉的箱子中并保持濕度在80 %以上以利于核盤菌生長。分別在接菌后24 h、36 h、48 h、60 h測量病斑大小并進行表型拍照，利用雙因素差異分析完成統計數據分析。

1.2.5Ss160的轉錄活性檢測 為研究Ss160是否具有轉錄激活活性，本研究將Ss160分別連入酵母的激活結構域（activation domain, AD）載體pGADT7和結合結構域（binding domain, BD）載體pGBKT7。具體載體構建方法為：用EcoR I 和BamH I 酶切pGBKT7或pGADT7獲得線性質粒，PCR 擴增回收Ss160CDS全長片段，之后利用同源重組法進行連接，連接體系為：6 μL pGBKT7線性載體、3 μLSs160回收產物、1μL Exnase Ⅱ、3μL 5×CEⅡBuffer、補ddH2O 至15 μL，之后37℃恒溫孵育器孵育30 min 以上。連接產物轉化大腸桿菌：-80℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α 感受態，冰上融化5 min，立刻加入重組產物，輕撥混勻，冰浴30 min；42℃熱激60 s，冰浴2 min；加入500 μL 新鮮LB 液體培養基，37℃條件下200 r/min 搖1 h；取200μL 菌液均勻涂布在固體LB（含50μg/mL Kan）培養基上，37℃培養箱倒置培養過夜。超凈臺中挑單克隆進行菌液PCR 并將陽性單克隆送測序，測序結果比對成功的菌液用50%的甘油1∶1 保菌，-80℃保存，連接成功的載體分別命名為AD-Ss160和BD-Ss160。

酵母感受態細胞的制備：從-80℃取出凍存的AH109 酵母菌株冰上解凍，在超凈工作臺中吸取10μL 菌液，在YPDA 固體培養基上劃線培養2～3 d。挑選直徑為3 mm 左右的單克隆于15 mL 的離心管中并加入3 mL 的YPDA 液體培養基中，28℃條件下220 r/min 過夜振蕩培養。取上述活化的培養液5μL 加入250 mL 的錐形瓶中，并加入50 mL YPDA 培養基，28℃條件下220 r/min 振蕩培養16～20 h后，用分光光度計測量OD600值，直到達到0.15～0.3。室溫條件下，將菌液700g離心5 min；棄上清，用100 mL 的YPDA 重新懸浮細胞沉淀，28℃條件下220 r/min 蕩培養3～5 h，用分光光度計測量OD600值，直至達到0.4～0.5。將上步中的培養液平均分裝到2 個50 mL的離心管中，室溫條件下，700g離心5 min，棄上清，分別用30 mL的無菌去離子水重新懸浮沉淀。室溫條件下，700g離心5 min，棄上清，分別用1.5 mL的1.1×TE/LiAc 重新懸浮細胞沉淀，將細胞懸浮液轉移到1.5 mL 的離心管，12 000 r/min 離心15 s，棄上清，用600 μL 的1.1 × TE/LiAc 重新懸浮細胞沉淀，酵母感受態細胞制備完成，立即用于轉化。

質粒轉化酵母感受態細胞：在預先預冷的1.5 mL 的離心管中加入兩個共轉的100 ng 質粒DNA 以及5μL 的Carrier DNA（使用前將Carrier DNA 變性，先在95～100℃條件下加熱5 min，再迅速置于冰上5 min，重復一次），加入50 μL 酵母感受態細胞，輕輕用槍吸打混勻，加入500μL 的PEG/LiAc，輕輕用槍吸打混勻，30℃溫育30 min，期間每隔10 min輕輕地顛倒混勻，加入20 μL 的DMSO 混勻，42℃水浴15 min，期間每隔5 min 溫和地混勻。13 000 r/min離心15 s，棄上清，用1 mL 的YPD 重新懸浮沉淀，28℃，220 r/min 振蕩培養1 h，13 000 r/min 離心15 s，棄上清，用1 mL 的0.9% (m/V) NaCl 溶液重新懸 浮，取100 μL 涂 布SD/-Leu/-Trp 平 板。SD/-Leu/-Trp 平板長出單克隆后，每對共轉質粒挑單克隆在超凈臺中用無菌水稀釋10 倍和100 倍，做4 個重復。取稀釋好的菌液用移液槍點到加入了X-α-Gal+AbA 的四缺固體培養基上，觀察長斑情況。分別將BD 空載與測序正確的AD-Ss160 載體或者AD空載與測序正確的BD-Ss160 共同轉化酵母菌株AH109，同時共轉陽性對照BD-p53 和AD-T 以及陰性對照BD-lam 和AD-T，兩個蛋白如若互作則可啟動報告基因表達，產生的蛋白產物能夠使得酵母因在缺陷型培養基上長斑或顯藍色，兩個蛋白若不互作，則無法啟動報告基因表達，無法在對應四缺培養基上長斑或顯藍。

1.3 統計分析方法

實驗數據導入SPSS 22.0 進行數據檢驗，數據符合正態分布，統計方法使用獨立樣本t 檢驗，采用均值±標準差表示，P＞0.05表示顯著差異性。

2 結果與分析

2.1 Ss160的克隆與序列特征分析

本研究在核盤菌中克隆得到Ss160基因序列，其CDS 序列長度為849 bp，共編碼282 個氨基酸。根據在線預測，其蛋白分子量大小為30 kDa，理論等電點pI 為4.43，不穩定系數為32.16，為穩定蛋白，平均疏水性為0.182，為親水蛋白。通過SignalP5.0 預測顯示Ss160 的N 端具有明顯的信號肽（圖1A）。TMHMM Server v. 2.0 預測顯示該蛋白不存在跨膜結構域。序列比對發現，該基因氨基酸序列在真菌中高度保守（圖1B），進化樹結果顯示Ss160 與灰霉、白腐菌、褐腐菌的親緣關系最近（圖1C）。為了解Ss160的高級結構，我們利用I-TASSER 軟件對蛋白進行三維結構預測，結果顯示Ss160主要有α-螺旋和無規則卷曲組成，無特殊結構域（圖1D）。

圖1 Ss160生物信息分析Fig.1 Bioinformatics analysis of Ss160

2.2 Ss160的亞細胞定位

基因的功能定位可揭示其執行功能的細胞場所，Ss160 作為一種可能參與核盤菌-植物互作中的效應蛋白，為探索Ss160 在植物細胞中的功能定位，本研究首先構建了帶有Ss160完整編碼框的GFP 融合蛋白表達載體35S::Ss160-GFP，將構建好的無堿基突變的重組質粒導入農桿菌備用；為明確目標基因的功能定位，本研究將已報道的能夠定位在細胞核和細胞膜的標記載體（FIB2-mCherry）[20]農桿菌菌液與含有35S::Ss160-GFP或空載體35S::GFP農桿菌菌液分別混合，共同注射適齡煙草葉片，黑暗培養12 h，光照培養36 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，結果表明，GFP空載體的綠色熒光與標記載體的紅色熒光在細胞膜和細胞核能夠很好的重疊為黃色熒光，說明二者共定位在細胞膜和細胞核，與對照相比，Ss160 與空載體的細胞定位無明顯差異（圖2），因此，Ss160 在植物細胞中無特異性的定位。

圖2 Ss160煙草亞細胞定位Fig.2 The subcellular localization of Ss160 in tobacco(Nicotiana tabacum)

2.3 瞬時表達Ss160煙草葉片菌核病抗病性鑒定

為了初步研究異源表達Ss160對植物菌核病抗性的影響，本研究選取生長期為4～5周的煙草，選取20～30 個長勢一致的葉片分別注射含有35S::Ss160-GFP和空載對照35S::GFP質粒的農桿菌菌液，經48 h 黑暗培養后，將瞬時表達35S::Ss160-GFP和35S::GFP的煙草葉片以及未注射的對照葉片離體接種核盤菌菌絲，濕度保持在80%以上黑暗培養。分別在接種后24 h、36 h、48 h、60 h測量病斑長度和寬度，進而進行病斑面積數據統計。結果表明，相比于野生型煙草葉片以及瞬時表達空載體的煙草葉片，瞬時表達Ss160 的煙草葉片菌核病病斑擴展速度明顯較慢，且隨著病害持續發展，病斑大小差異更加顯著; 數據統計同樣顯示異源表達Ss160 的病斑面積顯著低于對照（野生型和表達空載的葉片）（圖3）。該結果初步表明Ss160能夠提高植物對菌核病的抗性水平。

圖3 瞬時表達Ss160的煙草離體葉片接種核盤菌抗性鑒定Fig.3 Sclerotinia disease resistance examination of transient expression of Ss160 gene in tobacco(Nicotiana benthamiana)by detached leaves inoculation method

2.4 Ss160轉錄激活活性檢測

為探索Ss160 是如何在核盤菌-植物互作中發揮作用，本研究首先嘗試通過酵母系統證明Ss160是否具有轉錄激活活性。通過同源重組將Ss160基因連入酵母AD 和BD 載體，經測序比對后證明所構建的載體無堿基突變，發現四個轉化組合在二缺培養基培養3 d 能夠正常長斑，轉化成功（圖4），之后將二缺培養基上的單克隆用無菌水以10 倍和100倍梯度稀釋后用移液槍點到加入了AbA 和X-α-Gal的四缺培養基上，分別做4個重復，經3～4 d培養后，陽性對照在四缺培養基上正常生長，而陰性對照未長斑，證明實驗體系正常，而空BD與AD-Ss160以及空AD 與BD-Ss160 在共轉蛋白不互作的情況下，依然在四缺培養基上長斑（圖4），表明Ss160自身具有轉錄激活能力。

圖4 酵母雙雜交實驗證明Ss160的轉錄激活能力Fig.4 Transcript activation capacity of Ss160 examined by yeast two-hybrid assay

3 結論與討論

核盤菌的菌核在外界條件適應的情況下會萌發出子囊盤，繼而噴射出子囊孢子，空氣中的子囊孢子落入油菜以及其他作物的花瓣，以花瓣作為其天然培養基進行菌絲萌發和生長；被侵染的花瓣落到莖稈和葉片，使得菌絲進一步入侵植物形成病斑；菌絲在莖稈中生長并在維管組織中形成菌核堵塞植物體內的水分運輸，直至植株提前衰亡[21]。由核盤菌引起的菌核病是油菜發展面臨的重要病害，如該病害能夠全面防控，油菜產業將獲得一次質的飛躍。經過多年的研究，科學家利用化學藥劑[22,23]以及生物防治[24]（如盾殼霉等）等方法提高油菜對菌核病的抗性，取得了一定的效果，但是長遠來看，培育抗病品種是最為安全有效的方法[25,26]?？墒?，由于菌核病的致病機理復雜，油菜菌核病是由多個微效基因復雜調控，因此極大地限制了抗病品種選育的進程[27～29]。

近年來諸多研究從植物本身出發挖掘抗病基因，如多位學者在油菜中發現了多個能夠提高油菜菌 核 病 抗 性 的 基 因，如BnMPK3[30]、BnMPK6[31]、WRKY[32]以及一些調控植物細胞壁降解的酶類等，而從病原菌本身挖掘可能參與病原菌-植物互作的因子并進一步解析其在植物中的互作靶標是另一種尋找病原菌致病或植物抗病機理的思路和方法。目前這一方向已經取得了一些進展，比如Deb 發現黃單胞菌效應子XopQ可以通過與兩個14-3-3蛋白相互作用而抑制水稻免疫應答[33]，Giska 等研究表明丁香假單胞菌所分泌的效應蛋白HopQ1與菜豆14-3-3 蛋白相互作用可以介導菜豆的抗病效應[34]。柴亞茹等[35]通過干擾核盤菌基因SsCCS可以提高擬南芥菌核病抗性，研究過程和方向與本研究有一定相似性，但本研究是通過Ss160過表達來增強油菜抵抗核盤菌的能力；遠俊虎等[36]利用病毒介導的基因沉默技術對核盤菌中8個具有信號肽的未知功能基因進行功能探究，成功鑒定到了7 個編碼核盤菌分泌蛋白的基因，但也還需要進一步解析具體抗病機理。本研究基于三代組裝核盤菌基因組中預測到的候選效應蛋白，從中鑒定到一個可能參與核盤菌-植物互作的基因Ss160，其轉錄水平在核盤菌接種油菜葉片后不同時間點具有明顯變化，因此本研究進一步在核盤菌中克隆了該基因，該基因特征與效應蛋白基本特征（具有信號肽且蛋白?。┮恢?，序列在真菌界非常保守，暗示其功能具有保守性。功能實驗表明該基因在煙葉片并沒有特異性的定位，在煙草中瞬時表達表明該基因能夠明顯抑制核盤菌菌絲在葉片上的擴展，提高了煙草對菌核病的抗性。本研究還需要思考的是：Ss160是如何在植物體內激活其病害防御系統，從而提高其菌核病抗性？其在植物中下游的信號是如何傳遞的？通過酵母系統證實Ss160 具有轉錄激活活性，暗示其可能通過這種方式啟動植物特定基因的表達，但到底是何種植物防御相關基因受Ss160 激活而啟動是本研究后期將繼續探索的問題。Ss160 是否類似于細菌鞭毛蛋白flagellin 的N 末端高度保守多肽（flg22）[37]一樣能夠誘導植物的天然免疫？如是，植物又是如何識別Ss160進而激活其體內防御機制？此外，核盤菌作為一種以死體營養型為主要生活方式的病原真菌，其效應蛋白可能與植物特定基因互作啟動寄主介導的細胞程序性死亡從而達到其侵染植株的目的[38]，那么Ss160 在核盤菌致病性中扮演了怎樣的角色？后續將Ss160轉入擬南芥獲得轉基因植株后，以上問題將得到進一步的實驗驗證。綜上所述，本研究克隆了核盤菌基因Ss160并初步探討了該基因的特性以及在菌核病的具體功能，為后續該基因的功能研究及其在核盤菌-植物互作中的作用機理奠定基礎，也為未來油菜抗病基因篩選提供可能的線索。