一種抗菌自修復殼聚糖薄膜材料的制備和表征

宣紅云，錢嘉錫，李碧云，孫苗，袁卉華

1.南通大學 生命科學學院（南通， 226019）

2.南通理工學院 機械工程學院（南通， 226002）

0 引言

聚合物薄膜材料已廣泛用于生物醫學領域［1］。其特點在于低成本，易加工，便于大批次生產［2］。對于醫療設備和生物醫學等領域，特別是疫情大時代背景下，醫用防護材料需具備自修復和抗菌性能，能夠減少感染風險和延長使用壽命[3-4]。

自修復材料大致可以分為二種，一種是本征型自修復材料，另一種是非本征型自修復材料［5］。其中本征型自修復材料依靠自身聚合物內部的共價鍵或是非共價鍵，通過可逆的動態的特征實現自修復功能［6］，只需要加熱。加濕等方法就可以促進自修復［7］，從而使材料具備一定的穩定性與可靠性［8］。相比與非本征型修復材料，本征型修復材料可以實現多次自主修復，且不需要額外的催化劑［9］。在本征型自修復的基礎上，拓展出以主客體為主的自修復形式［10］，主體分子通常較大，并具有疏水或親水腔，可以嵌入較小的客體［11］。目前已有很多有關主客體分子的研究。以環糊精和金剛烷為例，環糊精具備的獨特空腔，能夠包裹住客體分子，形成絡合物［12-13］。但環糊精和金剛烷均不具備抗菌性能，無法應用于醫用防護方面，但可以通過抗菌劑的接枝或共混改性使其具備抗菌性能［14］。

殼聚糖（ Chitosan，CS）是一種具備良好生物相容性的天然堿性多糖，同時也具有抗菌性，無毒性等特點［15-16］。殼聚糖對于細菌、真菌有一定毒性［17］，但是對哺乳動物細胞毒性較低［18］。殼聚糖分子內部有數量較多的氫鍵，可以形成結晶區，從而具備良好的吸附能力［19］。因此，如果利用殼聚糖對環糊精和金剛烷分別進行修飾，將改善環糊精-金剛烷自修復材料的抗菌功能［20-21］。目前，利用殼聚糖的修飾環糊精和殼聚糖修飾的金剛烷經層層自組裝技術形成自修復的抗菌涂層薄膜的研究還未見報道。

擬采用殼聚糖、羧甲基殼聚糖分別修飾環糊精和金剛烷，進一步在玻璃片上經過層層自組裝技術制備聚合物薄膜。探討了該新型聚合物薄膜的自修復能力和抗菌能力。為殼聚糖基的主客體自修復涂層材料在生物醫學防護領域的應用提供了理論依據。

1 材料制備方法

1.1 材料和儀器

材料：冰醋酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；殼聚糖（CS）和羧甲基殼聚糖（CS-COOH），來自合肥博美生物科技有限責任公司；β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD），山東濱州智源生物科技有限公司；金剛烷胺（Amantadine，AD），上海笛柏有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride， EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）均為上海碧云天生物技術有限公司；LB培養基，上海源葉生物科技有限公司。

儀器：紅外光譜儀（TENSOR 27 ），德國布魯克公司；恒溫培養箱（DH4000BII），蘇州菲斯福電子材料有限公司；光學顯微鏡（DM2500），德國萊卡公司。

1.2 涂層材料的制備

首先需要制備主客體2種溶液，也就是環β-CD/CS溶 液 和 AD/(CS-COOH)溶 液。CS和CS-COOH先分別用3%冰醋酸溶液溶解，然后以10 mg/mL的濃度，向殼聚糖溶液中添加β-CD，避光振蕩，使環糊精充分溶解。5 mg/mL濃度的金剛烷胺加入至羧甲基殼聚糖溶液中，同時加入適量的EDC和NHS進行活化，避光振蕩12 h，使金剛烷胺充分溶解。在圓形的玻璃片上滴加β-CD-CS溶液，并輕輕涂勻填滿整個玻璃片表面，等待溶液自然風干，再滴加AD-(CS-COOH)溶液，輕輕涂勻，等待自然風干。多次反復上述操作（60周期），最終得到具有抗菌性能和自修復能力的β-CD-CS/AD-(CS-COOH)涂層薄膜。

為了檢測殼聚糖、羧甲基殼聚糖是否能夠被環糊精或是金剛烷胺修飾，需單獨制備涂有純β-CD-CS溶液的涂層與純AD-(CS-COOH)溶液的涂層，并使用紅外光譜儀進行分析。

1.3 自修復實驗

自修復實驗有3種：①單次劃傷修復實驗：用小刀輕劃涂層，使其暴露出一定寬度的傷口并在光學顯微鏡下觀察記錄。再用噴壺噴灑蒸餾水，使涂層進行自修復。在修復過程中，用光學顯微鏡持續觀察劃痕處，并記錄劃痕修復完成的時間。②根據實驗確定的劃痕修復完成的時間來進行多次劃傷修復實驗：多次劃傷修復實驗大體步驟與單次劃傷實驗相同，不同點在于反復劃傷，修復。用顯微鏡觀察在相同修復時間下，薄膜的傷口愈合情況。③截斷修復實驗：將制備好的涂層薄膜從玻璃載體上輕輕揭下，用剪刀截斷成兩半，一半用藍色染料染色進行對比。之后相互靠攏，噴水，使其自修復。

1.4 抗菌實驗

目前在抗菌實驗中，常用大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）作為評估材料的抗菌性能典型菌種。本次實驗分為2組進行，分別針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，并與空白組進行對比。先制備用于抗菌實驗的涂層薄膜。先將圓形玻璃片浸泡在無水乙醇中3 h，隨后進行紫外照射2 h。處理好的玻璃片上滴加β-CD-CS溶液，涂勻并自然風干，再滴加AD-(CS-COOH)溶液，涂勻風干。反復重復上述操作（60周期），直至涂層達到實驗所需的層數，形成實驗所需的涂層薄膜。

以大腸桿菌組為例，先將大腸桿菌培養在液體培養基中，溫度保持在37 ℃，振蕩孵育24 h。隨后在無菌操作臺內，分別取20 μL大腸桿菌菌液滴加在紫外照射2 h后有涂層的玻璃片上和沒有涂層的玻璃片上（作為對照組）。放入恒溫細菌培養箱內培養2 h。吸取涂層上液體，并使用0.85%的生理鹽水進行梯度稀釋。取適量的混合液，均勻涂布在預先配好的固體培養基（含有2% 瓊脂的LB液體培養基）內，再放入恒溫細菌培養箱進行培養，保持5% CO2和95% O2大氣范圍，溫度為37 ℃，培養24 h后取出，觀察并計算菌落數。金黃色葡萄球菌組操作步驟與大腸桿菌組大致相同，實驗平行樣品數為3。

2 結果

2.1 紅外分析

如圖1所示，根據CS, CS-COOH, β-CD-CS與AD-(CS-COOH)的分子結構式，和相應的紅外光譜分析發現，3 400 cm-1左右出現的特征峰為上述四種材料的O-H官能團（CS,β-CD-CS, CSCOOH分子中含有 ）或N-H（CS, CS-COOH, 分子中含有）官能團的伸縮振動峰，895 cm-1處為CS的β-糖苷鍵彎曲振動特征吸收峰，895 cm-1處為CS的β-（1,4）糖苷鍵彎曲振動特征吸收峰。1 690cm-1處的吸收峰是CS-COOH中羧酸基團中羰基的伸縮振動所產生的。形成復合物后羰基（C=O）的特征峰發生了一定的偏移出現在1 650cm-1附近處，且此處的峰出現了較為明顯的增強，這則是因為酰胺化反應的發生在聚合物中引入了更多的羰基基團所致［22-23］。

圖1 CD-CS與AD-(CS-COOH)的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of CD-CS and AD - (CS-COOH)

2.2 自修復結果

如圖2所示，在單次劃傷后，涂層薄膜的傷口隨著時間的增加逐漸愈合。結果顯示，經過20 min的修復，傷口基本愈合。多次劃傷后，涂層薄膜均能自主進行自修復，并且成功修復劃痕傷口，如圖3所示。在截斷之后，2片薄膜也可以通過自修復，成功修復成一個整體，而且用鑷子夾起至一定高度，薄膜也不脫落，如圖4所示。以上結果均證明該薄膜材料自修復效果良好。

圖2 CD-CS與AD-(CS-COOH)顯微鏡像Fig.2 Microscope image of CD-CS and AD - (CS-COOH)

圖3 CD-CS與AD-(CS-COOH)修復前后顯微鏡像Fig.3 Microscopic image before and after repair of CD-CS與AD-(CS-COOH)

圖4 涂層薄膜截斷修復實物圖Fig4 Physical map of coating film truncation repair

2.3 抗菌試驗結果

從圖5（a）可以明顯看出，大腸桿菌（E.coli）組中，未經過涂層薄膜培養過后的大腸桿菌菌液，其在培養基上的菌落數數量很多，而在涂層薄膜培養2 h后的菌液，其在培養基上的菌落數量顯著下降。圖5（a）顯示的金黃色葡萄球菌（S.aureus）組結果與大腸桿菌組結果相同。且2組菌種的菌落數量下降幅度超過90%，材料抗菌性能接近100%，如圖5（b）所示，實驗組與空白組之間存在顯著的差異。

圖5 抗菌實驗結果Fig 5 Antibacterial test results

3 結語

將玻璃作為涂層的支持物，通過層層自組裝技術，將β-CD-CS與AD-(CS-COOH)組裝成有一定厚度的涂層，并粘附在玻璃片上。檢測了環糊精和金剛烷是否能夠與殼聚糖聚合，測試了這種涂層的自修復能力和抗菌能力。羧甲基殼聚糖在1 690 cm-1和1 530 cm-1處分別為羧酸基團羰基的特征吸收峰和氨基的特征峰。殼聚糖出現在1 530 cm-1處的吸收峰為氨基的面外彎曲振動所產生的，也是氨基鍵的峰值表征，證明殼聚糖含有氨基官能團。而在經過環糊精和金剛烷修飾過后的殼聚糖，原先的C=O官能團峰值會向低波段偏移。C=O官能團從1 690 cm-1偏移至1 650 cm-1，這是因為N原子中的孤電子對和羧基之間形成了p-π共軛作用。而N-H官能團則會向高波段偏移，如圖1（b）所示，N-H官能團從CS的1 530 cm-1偏移至βCD-CS的1 570 cm-1，N-H官能團從CS-COOH的1 530 cm-1偏移至AD-(CS-COOH)的1 545 cm-1。以上的現象表明了被修飾過的殼聚糖有新的酰胺鍵形成，證明了殼聚糖可以被環糊精和金剛烷修飾，從而構建涂層薄膜。

通過劃痕和截斷實驗來證明材料的自修復能力。實驗結果表明，單次和多次劃傷后，涂層薄膜都能夠進行愈合。如圖3、圖4所示，劃痕明顯消失。而且在截斷之后，涂層薄膜仍然能夠進行自修復，重新聯結成一個整體，且不易斷裂，重新修復的涂層薄膜仍具有一定黏性。其原理為，當膜上的劃痕或是缺口暴露于濕潤環境中時，劃痕或是缺口兩側的材料相互接觸后，材料中的β-CD-CS分子與AD-(CS-COOH)分子能夠發生主客體作用，分子之間重新排列組合，隨著薄膜內的水分子蒸發，自修復也在進行。在實驗過程中我們還發現，反復堆疊的層數越多，其自修復能力越強。但相對的其厚度越大，透光性越低。

通過使用大腸桿菌，金黃色葡萄球菌對涂層的抗菌能力進行評價，結果表明，涂層材料對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的抗菌效果超過了95%。證明了該涂層材料具有優良的抗菌性能，能夠有效抑制細菌在涂層上的生長。該涂層材料抗菌原因很大程度上是因為殼聚糖富含氨基，使自身具有抗菌的特性，而且這種特性在經過其他物質修飾之后，仍可以被保留。同時涂層薄膜的結構特性使得細菌難以生存，該材料自身具備一定的抗菌能力。

綜上所述，我們探究了殼聚糖修飾的環糊精與羧甲基殼聚糖修飾的金剛烷，通過自組裝形成的涂層薄膜材料，對材料自身的自修復能力和抗菌能力做了系統性的探究，從而為接下來探索該材料的細胞相容性等功能提供了理論基礎［24］。結果證明了該材料有良好的自修復能力與抗菌能力，能夠用于醫療設備或是生物醫學工程等方面，例如用于口罩、防護服等防護裝置的涂層，并在生物醫學工程方面擁有廣闊的應用前景。