二氫辣椒素不依賴誘導亞低溫對心臟驟停復蘇后腦損傷的防治作用及分子機制

鐘曉芃， 郭 義， 張詩武

近年來心臟驟停(cardiac arrest, CA)患者生存率顯著提高[1]。但這一部分患者多數遺留神經系統不可逆損傷及后遺癥，造成巨大的社會及經濟負擔[2]。因此，心肺功能恢復不是心臟驟?；颊邚吞K成功的唯一指標，腦復蘇意義重大[3]。

二氫辣椒素(dihydrocapsaicin, DHC)是激活瞬時受體電位香草型1(transient receptor potential vanilla 1, TRPV1)受體的激動劑，包括筆者在內的多項研究[4-5]證明它對心臟驟停后的缺血-再灌注腦損傷有保護作用，并認為這種保護作用與誘導亞低溫有關，然而我們前期的實驗中發現這種保護作用并不完全依賴于誘導亞低溫，但是機制并不完全清楚。為了證實二氫辣椒素不依賴誘導亞低溫的腦保護作用及其分子機制，本研究設計了動物實驗及細胞實驗，揭示二氫辣椒素對心臟驟停復蘇后缺血再灌注腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(年齡49～60天，體質量222～373 g)18只，由中國科學院放射學研究所動物中心提供，隨機分配到三組：①假手術組(n=6)，只行氣管插管，不誘導心臟驟停和進行心肺復蘇(CPR); ②復蘇組(n=6)，應用氣管夾閉窒息法誘導心臟驟停后行常規CPR; ③辣椒素組(n=6)，在常規的CPR基礎上腹腔注射二氫辣椒素。本研究經天津市人民醫院實驗動物管理委員會批準(編號：2021-SYDWLL-000175)。

1.2CPR SD大鼠造模前晚禁食不禁水，使用戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉。使用14號氣管插管經口直視插入。左股動脈置入23號PE-50聚乙烯管，并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監測儀(Germany)監測心電圖、血壓及直腸溫度。手術完成后，待大鼠生理參數穩定開始夾閉氣管插管，觀察大鼠呼吸、心搏和血壓，心搏停止以動脈收縮壓<20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)作為心臟驟停標準。心臟驟停后開始進行CPR，胸外按壓頻率為200次/min，同步機械通氣頻率為100次/min，以胸廓前后徑的1/3為按壓深度標準，吸入100%濃度氧。2 min后，靜脈注射腎上腺素0.025 mg/kg，CPR 10 min，如果出現室顫立即除顫，如心率血壓恢復[恢復室上性心律，平均動脈壓(MAP)>60 mm Hg，維持5 min以上]則停止按壓，10 min后未恢復心率血壓為復蘇失敗。復蘇成功后1 h拔除所有插管，蘇醒后放回籠中飼養，使用保溫設備維持大鼠肛溫在36.5 ℃左右。

1.3二氫辣椒素預處理 使用 1%DMSO溶解二氫辣椒素溶液，誘導心臟驟停前3 h腹腔注射0.2 mg/kg[6]。

1.4紙帶移除實驗[7]在進行實驗的3 d前開始對大鼠進行訓練。在復蘇成功后72 h進行紙帶移除實驗，統計大鼠移除黏性膠帶的時間，以180 s為觀察終點，共統計3次取平均值。

1.5TUNEL法檢測大腦皮層細胞凋亡 72 h后以斷頭法處死大鼠，取大鼠腦組織固定、包埋、切片，進行TUNEL檢測。

1.6免疫組化法檢測大腦皮層區TRPV1、PKA及 UCP-4表達 復蘇成功后72 h斷頭處死大鼠，取大腦皮層組織切片、固定，加入山羊血清封閉液孵育1 h，兔抗鼠TRPV1抗體1∶1000，4 ℃過夜。次日切片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗，加入山羊抗兔抗體(1∶100)，室溫孵育1 h，充分清洗之后使用熒光顯微鏡觀察攝片。

1.7Western blot檢測大腦皮層區TRPV1、PKA及UCP-4蛋白表達 大鼠大腦皮層組織冰浴勻漿，4 ℃進行兩次離心(12 000 r/min， 30 min)，蛋白定量之后電泳，轉膜，封閉，加兔抗大鼠TRPV1、caspase-3及UCP-4單克隆抗體(1∶1000)，二抗為羊抗兔IgG，使用凝膠成像圖像系統進行分析。

1.8腦組織活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測 測定0.5 g大腦皮層組織，置1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，勻漿，離心10 min(4000 r/min)，取上清液，根據試劑盒說明進行實驗。

1.9細胞培養和分組 將生長情況良好的神經瘤母細胞(SH-SY5Y)放置于細胞培養箱(37 ℃，濕度飽和適宜，95%空氣和5%CO2)中培養，細胞培養基組成為1%雙抗、10%FBS和90%高糖DMEM。按照1∶3比例進行傳代培養，3 d后把細胞分為五組。①對照組：細胞正常培養。②糖氧剝奪/復氧復糖組(OGD/R組)：將無糖的D.Hank′s液放入乏氧培養箱(5%CO2/95%N2) 30 min，使氧濃度<1%。使用無糖D.Hank′s液將細胞清洗4次，最終使葡萄糖濃度<1 mmol/L。把細胞放入厭氧罐內，自開始換液時開始計時至6 h，棄除無糖D.Hank′s液，更換為完全培養液，放入CO2培養箱繼續孵育到24 h，用來模擬人體內神經細胞缺血-再灌注過程。③辣椒素組: 無糖培養基缺氧培養6 h，用PBS清洗，最后加入含二氫辣椒素(10 μmol/L)的培養基復糖復氧培養24 h。④辣椒平(capsazepine， CPZ)組：先加入辣椒平(10 μmol/L)處理1 h，再換無糖培養基缺氧培養6 h，用PBS清洗，最后加入含二氫辣椒素的完全培養基復氧復糖繼續培養24 h。⑤H-89組：先加入PKA抑制劑H-89(100 μmol/L)處理1 h，再換無糖培養基缺氧培養6 h，用PBS清洗，最后加入含二氫辣椒素的完全培養基復氧復糖繼續培養24 h。

1.10Western blot檢測SH-SY5Y細胞相關蛋白 蛋白定量、電泳、轉膜、封閉，一抗為兔抗大鼠單克隆抗體(1∶1000)，羊抗兔IgG為二抗，顯色，凝膠成像圖像分析。對照為抗β肌動蛋白抗體(β-actin)。

1.11流式細胞學檢測SH-SY5Y細胞凋亡 將各組細胞收集到離心管內，1200 r/min 5 min離心，去上清，加PBS重懸；用PBS將細胞潤洗2次，離心1200 r/min 5 min；流式細胞儀分析。

1.12流式細胞學檢測SH-SY5Y細胞ROS熒光強度 將各組細胞收集到離心管內，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞終止消化后收集，離心1200 r/min 5 min，去上清，加PBS重懸；將細胞潤洗2次，離心1200 r/min 5 min；流式細胞儀分析檢測細胞內DCFH-DA與ROS結合的熒光強度。

1.13流式細胞學檢測SH-SY5Y細胞線粒體膜電位 將各組細胞收集，離心1200 r/min 5 min，棄上清，加入0.5 mL JC-1染色工作液，細胞培養箱中37 ℃孵育20 min；孵育結束時，離心5 min (1200 r/min)，細胞沉淀，棄上清液； 經JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，重懸之后經流式細胞儀分析。

1.14流式細胞學檢測SH-SY5Y細胞線粒體內鈣熒光強度 根據說明書使用細胞線粒體提取試劑盒提取線粒體。經3次洗滌，用胰酶消化，6000 r/min離心5 min后收取細胞。加入臺盼藍染色液30 μL，在陽性比超過50%時停止勻漿。把細胞勻漿4 ℃，11 000 r/min離心10 min。沉淀即為分離得到的細胞線粒體，流式細胞儀上機檢測，利用流式細胞儀測得Fluo-3與線粒體內Ca2+結合的熒光強度。

2 結果

2.1紙帶移除實驗 假手術組、復蘇組及辣椒素組大鼠紙帶移除時間分別為 (15±2)s、(143±31)s和(98±17)s，假手術組明顯少于復蘇組(P<0.0001)，辣椒素組明顯少于復蘇組(P<0.0046)。見圖1。

注：*P<0.05圖1 各組大鼠紙帶移除時間

2.2大腦皮層神經元凋亡 盡管假手術組大鼠大腦皮層中有一些染色表明凋亡細胞，但辣椒素組和復蘇組的染色程度更高。假手術組、復蘇組和辣椒素組的染色積分光密度值(IOD值)反映了凋亡細胞的數量，分別為1755.21±64.11、2473.24±279.71和2010.31±95.31，假手術組明顯少于復蘇組(P<0.00001)，辣椒素組明顯少于復蘇組(P=0.001)。見圖2。

2.3大腦皮層PKA表達

在假手術組中觀察到PKA染色，但在辣椒素組中染色程度更高，染色的IOD值反映了PKA表達水平，假手術組、復蘇組和辣椒素組分別為1711.13±51.35、2012.24±75.54和2451.41±87.21，辣椒素組明顯高于復蘇組(P<0.001)。見圖2。

假手術組、復蘇組和辣椒素組相對PKA含量分別為0.435±0.021、0.413±0.032和0.631±0.041，辣椒素組明顯低于復蘇組(P<0.0004)，假手術組與復蘇組比較差異無統計學意義(P=0.0699)。見圖3。

2.4大腦皮層UCP-4表達

在假手術組中觀察到UCP-4染色，但在復蘇組和辣椒素組中染色程度更高，染色的IOD值反映了UCP-4表達水平，假手術組、復蘇組和辣椒素組分別為1538.13±59.82、2011.41±103.22和2421.24±209.76，假手術組明顯低于復蘇組(P<0.001)，復蘇組明顯低于辣椒素組(P=0.0004)。 見圖2。

假手術組、復蘇組和辣椒素組相對UCP-4含量分別為0.3960±0.0410、0.3351±0.0490和0.601±0.0870，假手術組與復蘇組比較差異無統計學意義(P=0.4970)， 辣椒素組明顯高于復蘇組(P=0.0047)。見圖3。

2.5大腦皮層TRPV1表達

假手術組、復蘇組切片的TRPV1染色強度低，而辣椒素組切片的TRPV1染色強度高。反映TRPV1表達的染色IOD值在假手術組、復蘇組和辣椒素組中分別為1523.12±82.23、1587.77±77.24和2301.12±61.23，辣椒素組明顯高于復蘇組(P<0.0001)及假手術組(P<0.0001)。見圖2。

注：TRPV1為瞬時受體電位香草型1；*P<0.05圖2 各組大鼠大腦皮層神經元凋亡及PKA、UCP-4、TRPV-1表達

注：TRPV1為瞬時受體電位香草型1；*P<0.05圖3 各組大鼠大腦皮層相對TRPV1、UCP-4、PKA含量

假手術組、復蘇組和辣椒素組相對TRPV1含量分別為0.440±0.038、0.478±0.049和0.801±0.043，辣椒素組明顯高于復蘇組(P=0.0002)及假手術組(P=0.0020)。見圖3。

2.6大腦皮層組織ROS 假手術組、復蘇組和辣椒素組ROS含量分別為(18.2±2.0)pg/mg、(47.6±2.7)pg/mg和(35.64±2.2)pg/mg，復蘇組明顯高于假手術組(P<0.0001)及辣椒素組(P<0.0001)。見圖4。

注：ROS為活性氧簇；*P<0.05圖4 各組大鼠大腦皮層組織ROS含量

2.7二氫辣椒素對OGD/R條件下SH-SY5Y細胞TRPV1、PKA的影響

Western blot結果顯示，對照組、OGD/R組、辣椒素組、辣椒平組及H89組相對PKA蛋白含量為0.671±0.021、0.235±0.034、0.540±0.042、0.354±0.013、0.337±0.025。與對照組比較，OGD/R組SH-SY5Y細胞PKA表達明顯降低(P<0.0001)；與OGD/R組比較，辣椒素組SH-SY5Y細胞PKA表達明顯升高(P<0.0001)；與辣椒素組比較，H89組、辣椒平組SH-SY5Y細胞PKA表達明顯降低(P=0.0025、0.0047)；H89組、辣椒平組相似(P>0.9901)。

對照組、OGD/R組、辣椒素組、辣椒平組及H89組相對TRPV1蛋白含量分別為0.157±0.011、0.164±0.033、0.592±0.039、0.312±0.024、0.361±0.031。與對照組比較，辣椒素組SH-SY5Y細胞TRPV1表達明顯升高(P<0.00001)；與OGD/R組比較，辣椒素組SH-SY5Y細胞TRPV1表達明顯升高(P<0.0001)；與辣椒素組比較，H89組、辣椒平組SH-SY5Y細胞TRPV1表達明顯降低(P=0.0004、0.0001)；H89組、辣椒平組相似(P>0.6371)。見圖5。

注：TRPV1為瞬時受體電位香草型1；OGD/R為糖氧剝奪/復氧復糖；*P<0.05圖5 各組大鼠SH-SY5Y細胞UCP-4、caspase-3、PKA、TRPV1表達

2.8二氫辣椒素通過激活TRPV1/PKA信號途徑對OGD/R條件下SH-SY5Y細胞UCP-4的影響 Western blot結果顯示，對照組、OGD/R組、辣椒素組、辣椒平組及H89組相對UCP-4表達分別為0.197±0.022、0.213±0.043、0.517±0.048、0.344±0.026、0.381±0.027。與對照組、OGD/R組比較，辣椒素組SH-SY5Y細胞UCP-4表達升高(P<0.0001)；與辣椒素組比較，H89組、辣椒平組SH-SY5Y細胞UCP-4表達明顯降低(P=0.0023、0.0003)；H89組、辣椒平組相似。與對照組(11.226±0.911)比較，其余各組JC-1探針紅綠色熒光強度比明顯減小，OGD/R組(0.988±0.002，P<0.001)，辣椒素組(5.104±0.001，P<0.001)，辣椒平組(2.034±0.011,P<0.001)，H89組(1.445±0.009,P<0.001)；與辣椒素組比較，OGD/R組、辣椒平組及H89組紅綠色熒光強度比明顯減小(P<0.001、=0.075、=0.021)。見圖6。

2.9二氫辣椒素通過激活TRPV1/PKA信號途徑抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞線粒體Ca2+超載 流式細胞結果發現，與對照組比較，其余四組線粒體內鈣離子熒光強度增強，其中OGD/R組(P=0.0002),辣椒素組(P=0.0272),辣椒平組(P=0.0035),H89組(P=0.0153)；與辣椒素組比較，OGD/R組、辣椒平組及H89組線粒體內鈣離子熒光強度明顯增強(P=0.0082、0.0043、0.0010)。見圖6。

2.10二氫辣椒素通過激活TRPV1/PKA信號途徑抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激因子產生 流式細胞結果發現，與對照組比較，OGD/R組ROS熒光強度明顯增強(P<0.0001)；與OGD/R組比較，辣椒素組ROS熒光強度明顯減小(P<0.001)；與辣椒素組比較，辣椒平組、H89組ROS熒光強度明顯增強(P<0.001、=0.001)。見圖6。

2.11二氫辣椒素通過激活TRPV1/PKA信號途徑抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞caspase-3蛋白表達 Western blot結果顯示，對照組、OGD/R組、辣椒素組、辣椒平組及H89組相對caspase-3表達分別為0.162±0.013、0.669±0.023、0.299±0.038、0.518±0.046、0.516±0.041。與辣椒素組比較，OGD/R組、H89組、辣椒平組SH-SY5Y細胞caspase-3表達明顯升高(P=0.0004、0.0199、0.0190)；與對照組比較，辣椒素組SH-SY5Y細胞caspase-3表達差異無統計學意義(P=0.182)。見圖5。

2.12二氫辣椒素通過激活TRPV1/PKA信號途徑抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞凋亡 流式細胞結果顯示，與對照組比較，OGD/R組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯升高(P=0.0102)；與辣椒素組比較，OGD/R組、辣椒平組、H89組SH-SY5Y細胞凋亡率明顯升高(P=0.0279、0.0271、0.0150)。見圖6。

注：OGD/R為糖氧剝奪/復氧復糖；ROS為活性氧簇；*P<0.05圖6 各組大鼠SH-SY5Y細胞凋亡、線粒體膜電位、ROS和鈣離子熒光強度

3 討論

Fosgerau等[8]研究發現，二氫辣椒素可以激活TRPV1受體引起實驗動物的亞低溫。隨后的研究集中于二氫辣椒素誘導亞低溫治療心臟驟停復蘇后腦損傷[4-5]及缺血性中風腦損傷[6,9-10]，這些研究者認為這種保護作用是因為亞低溫的作用。而本實驗使用加溫設備使各組實驗動物保持相同的體溫，細胞實驗更是很好地消除了溫度的影響，而二氫辣椒素對心臟驟停、氧糖剝奪/復糖復氧的中樞神經細胞均有保護作用，結果有統計學意義。

有研究顯示，神經細胞在缺血-再灌注時，因為組織氧灌注恢復，引起激烈的線粒體氧化應激反應，線粒體ROS及活性氮簇(RNS)生成增加[11]。過度的線粒體氧化應激將引起線粒體功能障礙，表現為線粒體膜電位降低，線粒體內出現鈣超載[12-13]。本實驗發現，OGD/R可導致SH-SY5Y細胞線粒體內鈣離子濃度增加，ROS生成增加，線粒體膜電位降低，給予二氫辣椒素預處理后，可減少OGD/R損傷下ROS的生成，提高線粒體膜電位，減少線粒體內鈣離子濃度，提示二氫辣椒素可減輕OGD/R誘導的線粒體氧化應激，保護線粒體功能。

已知大腦皮層和海馬都含有大量的UCP-4。UCP-4激活可以調節神經元能量生成，達到神經保護和腦細胞氧化應激調節的作用[14]。當大腦神經細胞處于氧化應激時，UCP-4可通過降低ROS 生成而起到抗氧化作用，減少細胞凋亡[15-16]。二氫辣椒素預處理可使UCP-4過表達，caspase-3蛋白表達降低，SH-SY5Y細胞的凋亡細胞數量減少，由此推測UCP-4可能也參與了缺血再灌注損傷導致的SH-SY5Y細胞凋亡。

據文獻報道，提高大鼠海馬組織cAMP含量，可以促進PKA磷酸化，活化cAMP-PKA信號通路，從而保護海馬神經元[17]；如果減低PKA蛋白磷酸化水平，會導致海馬神經細胞凋亡[18-19]。本實驗發現，氧糖剝奪6 h再復氧復糖24 h后，SH-SY5Y細胞PKA表達和對照組比較有所降低，說明氧糖剝奪再復糖復氧可以抑制PKA表達；二氫辣椒素預處理后，PKA表達增加，且UCP-4表達增加，凋亡細胞減少；同時使用二氫辣椒素抑制劑辣椒平抑制TRPV1表達和應用PKA抑制劑H89抑制PKA 表達，則 UCP-4表達降低，凋亡細胞增加。

本實驗發現，心臟驟停前3 h應用二氫辣椒素預處理可改善心臟驟停后大鼠的神經功能,同時TUNEL分析顯示，與對照組比較,二氫辣椒素預處理組實驗動物大腦皮層神經細胞凋亡得到改善。進一步的組織學檢查及Western檢查也證實了大腦皮層增加了PKA和UCP-4表達,同時ROS含量減少,從而減少了缺血-再灌注的氧化應激損傷。

綜上所述，二氫辣椒素激活TRPV1受體可通過cAMP/PKA信號通路，增加線粒體解偶聯蛋白表達，提高被缺血再灌注損傷降低的線粒體膜電位,減少ROS的產生,抑制凋亡因子釋放,從而減少缺血再灌注損傷導致的神經元細胞凋亡。