體外膜肺氧合對心肺復蘇大鼠海馬凋亡蛋白及內質網應激的影響

蘇世瓊， 劉瑞芳

心臟驟停(cardiac arrest， CA)是醫院內外常見且難治性疾病，是由于各種原因造成的心臟搏動停止導致重要器官嚴重缺血缺氧甚至最終死亡的臨床危急重癥[1]。雖然更快速和有效的心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation， CPR)可以緩解CA后的結局，但CA/CPR后的病死率和神經功能不良預后發生率仍然很高，這是由于復蘇后的腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury， CIRI)導致的[2]。而CIRI的發生機制與氧化應激、鈣超載、線粒體功能障礙、炎癥反應、神經元凋亡等多種因素有關，其中氧化和抗氧化防御系統失衡導致的氧化應激反應在誘導CIRI的發生中起到重要的作用，積累的自由基觸發細胞膜脂質過氧化，也可通過線粒體、內質網或死亡受體啟動神經元凋亡級聯反應，導致神經功能障礙和細胞死亡[3]。近年來，內質網應激作為一種與腦缺血病理過程相關的凋亡新機制受到廣泛關注。內質網應激后，啟動未折疊蛋白反應有助于恢復內質網的活性，參與協調神經細胞凋亡，從而改善神經功能障礙[4]。有研究[5]顯示，右美托咪定可以通過調節內質網應激相關蛋白來部分抑制由內質網應激誘導的凋亡，從而減輕CIRI。此外，有研究[6]證實，淫羊藿苷通過調節PI3K/AKT信號通路抑制內質網應激凋亡蛋白的表達，從而對內質網應激誘導的神經細胞凋亡起到保護作用。以上研究為CA/CPR后CIRI的干預提供依據。CA發生時，及時有效地為患者提供循環呼吸支持可降低并發癥發生率和病死率。體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation， ECMO)通過代替心臟泵血功能和肺臟的氧合功能為患者提供暫時的呼吸和循環支持。有研究[7]發現，ECMO輔助CPR能夠明顯提高CA患者的生存率，改善神經結局。但目前ECMO應用于CA患者CPR中的研究較少，且通過何種途徑及機制減輕患者腦損傷作用也尚未闡明。因此，本研究通過構建CA大鼠模型，探討ECMO對大鼠海馬凋亡蛋白及內質網應激的影響，為ECMO在臨床上CA患者治療中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥品及主要試劑

1.1.1 實驗動物 50只SPF級雄性SD大鼠購自山東省實驗動物中心，15個月齡，體重280～320 g，動物合格證號：SCXK(魯)2017-007。于SPF房內55%～65%相對濕度、20～25 ℃室溫、12 h/12 h陰暗交替光照條件下適應性飼養1周后進行實驗，飼養期間允許大鼠自由攝食飲水。本研究獲得河南省直第三人民醫院實驗動物倫理委員會的批準(批準文號：3128-14)。

1.1.2 藥品及主要試劑 二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370，規格0.5 g×20片)；鹽酸利多卡因注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H44020243，規格5 mL:0.1 g)；胎牛血清(美國Gibco公司)；兔超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1， SOD1)抗體、兔SOD2抗體、兔Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、兔B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)抗體、兔天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體、兔3-磷酸甘油醛脫氫酶(GRP78)抗體、兔X-盒結合蛋白1(XBP1)抗體(美國Abcam公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidine-2-phenylindole， DAPI)、抗熒光衰減密封劑(北京索萊寶科技有限公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海翌圣生物科技股份有限公司)；BCA蛋白質檢測試劑盒(上海生工公司)。

1.2方法

1.2.1 模型制備及分組

1.2.1.1 分組 采用隨機數字表法將50只健康SD雄性大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、ECMO組和二甲雙胍組，每組10只。

1.2.1.2 造模前處理 二甲雙胍組造模前14 d以200 mg/(kg·d)的劑量連續灌胃給予二甲雙胍，共14 d。ECMO組造模前建立ECMO系統(由儲血室、滾壓泵、膜肺及配套管路組成)，手術部位備皮、消毒，1%利多卡因局部浸潤麻醉，游離右頸外靜脈、右股動脈及尾動脈，其中右頸外靜脈置入靜脈引流管，右股動脈置入24 G套針管并注射0.5 mL的300 U/mL肝素，連接生理記錄儀檢測血壓和心率，尾動脈置入20 G套針管，用于ECMO動脈段灌注；ECMO管路均采用包含300 U/mL肝素0.5 mL及6%羥乙基淀粉13 mL的無血預沖液預沖。

1.2.1.3 CA模型制備 按3 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉模型組、ECMO組和二甲雙胍組大鼠，采用經食道交流電刺激60 s的方法[8]制備CA模型。6 min后二甲雙胍組行常規CPR治療，ECMO組在ECMO輔助下行CPR，模型組不進行CPR治療。假手術組僅行麻醉、分離股動靜脈及插管，不進行電刺激及CPR；正常組不進行任何處理。

1.2.2 神經功能評分測試 采用神經功能評分系統對各組大鼠模型制備完成后及恢復自主循環后24 h的神經功能進行評價，包括一般行為缺陷(意識、知覺、覺醒、呼吸，共19分)、腦干功能(嗅覺、視覺、瞳孔對光反應、角膜反應、驚跳反應、胡須刺激反應、吞咽，共21分)、運動強度評估(共6分)、感覺評估(疼痛刺激反應，共6分)、自主行為(步態協調、平衡木行走，共6分)、反射(正位反射及直反射、拒絕趨地反射、視覺配合、轉向實驗，共12分)、癲癇發作(痙攣性或非痙攣性，共10分)，滿分80分為正常，評分越低提示大鼠神經功能缺損越嚴重，0分為腦死亡。

注：ECMO為體外膜肺氧合；CPR為心肺復蘇圖1 大鼠ECMO輔助下CPR管路圖

1.2.3 海馬組織病理學檢查 恢復自主循環后72 h處死大鼠，取各組大鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，37 ℃烘干，脫蠟，水化，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇浸泡分化，漂洗，脫水，蘇木素-伊紅(HE)染色，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下(×400)觀察各組大鼠海馬組織病理學形態。

1.2.4 免疫熒光染色觀察海馬組織SOD1、SOD2表達 各組大鼠海馬組織石蠟切片烘干，脫蠟，3% H2O2浸泡去除內源性過氧化物酶，檸檬酸鈉緩沖液高壓修復，與SOD1、SOD2一抗于4 ℃孵育過夜。陰性對照組用PBS代替一抗。PBS中洗滌3次，每次5 min，加入二抗于37 ℃孵育1 h，PBS洗滌。DAPI復染2 min，PBS沖洗3次。使用適量的抗熒光衰減密封劑進行密封。在共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)下觀察熒光強度。

1.2.5 TUNEL檢測海馬組織細胞凋亡 采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測海馬組織神經元細胞凋亡情況。海馬組織用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定24 h，用含有0.1% Triton X-100的PBS溶液在室溫下放置5 min。 干燥組織，加入50 mL反應混合物(酶濃縮液∶標記溶液=1∶9)，在濕箱中37 ℃避光孵育1 h。 用PBS重新洗滌載玻片，每個切片在熒光顯微鏡(400×)下隨機選擇5個視野觀察海馬組織細胞凋亡情況。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 免疫組化分析海馬組織凋亡相關蛋白及內質網應激相關蛋白表達 大鼠海馬組織切片脫蠟，水化，3% H2O2浸泡抑制內源性過氧化物酶活性，用檸檬酸鈉緩沖液對切片進行微波修復，冷卻，PBS洗滌。非特異性結合位點于37 ℃用10%胎牛血清阻斷1 h。加Bax、Bcl-2、Caspase-3、GRP78、XBP1一抗于4 ℃孵育，次日取出切片，PBS洗滌，加山羊抗小鼠二抗于37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌殘留二抗，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine， DAB)染色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水封片。光學顯微鏡下觀察Bax、Bcl-2、Caspase-3、GRP78、XBP1表達情況，計算陽性細胞率。

1.2.7 Western blot分析海馬組織凋亡相關蛋白及內質網應激相關蛋白表達 RIPA緩沖液提取各組大鼠海馬組織中的總蛋白質，BCA蛋白質檢測試劑盒測定其濃度。97 ℃下變性5 min，電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，將膜與針對Bax、Bcl-2、Caspase-3、GRP78、XBP1的特異性一抗在4 ℃下孵育過夜，采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)偶聯的二抗在37 ℃下再孵育1.5 h。 使用增強型化學發光試劑及Image Lab軟件(美國Bio-Rad公司)觀察蛋白質印記并分析條帶密度。

2 結果

2.1神經功能評分 造模完成后的模型組、ECMO組、二甲雙胍組大鼠神經功能評分均明顯低于正常組和假手術組(P<0.05)，提示模型制備成功?；謴妥灾餮h后24 h，模型組大鼠神經功能評分明顯低于正常組(P<0.05)，ECMO組、二甲雙胍組明顯高于模型組(P<0.05)，ECMO組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：A為模型制備完成后神經功能評分的比較；B為恢復自主循環后24 h神經功能評分的比較；ECMO為體外膜肺氧合；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 各組大鼠神經功能評分的比較

2.2海馬組織HE染色結果 HE染色結果顯示，正常組和假手術組大鼠海馬組織細胞著色均勻，細胞核及核仁大小正常，錐體細胞排列整齊有序，組織形態及結構正常；模型組大鼠海馬組織細胞結構模糊甚至丟失，胞核及胞漿著色不均勻，細胞核固縮深染，核仁變小甚至消失，錐體細胞呈松散排列，神經元腫脹呈透明空泡化，組織形態及結構紊亂；ECMO組和二甲雙胍組大鼠海馬組織病理形態較模型組明顯改善，細胞空泡化明顯減少，神經元胞漿及胞核著色較均勻，組織形態基本規則。見圖3。

注：ECMO為體外膜肺氧合圖3 各組大鼠海馬組織HE染色結果的比較(×400)

2.3海馬組織SOD1、SOD2表達情況的比較 模型組大鼠海馬組織SOD1、SOD2的熒光強度明顯低于正常組(P<0.05)，ECMO組、二甲雙胍組明顯高于模型組(P<0.05)，ECMO組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為SOD1表達情況的比較；B為SOD2表達情況的比較；ECMO為體外膜肺氧合；SOD1為超氧化物歧化酶1，顯示為紅色熒光；SOD2為超氧化物歧化酶2，顯示為紅色熒光；DAPI為細胞核染色，顯示為藍色熒光；Merged為SOD1與DAPI、SOD2與DAPI染色結果圖像擬合；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 免疫熒光染色觀察各組大鼠海馬組織SOD1、SOD2表達情況的比較

2.4海馬組織神經元細胞凋亡情況 模型組大鼠海馬組織神經元細胞凋亡率明顯高于正常組(P<0.05)，ECMO組、二甲雙胍組明顯低于模型組(P<0.05)，ECMO組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

注：ECMO為體外膜肺氧合；TUNEL為凋亡細胞染色，顯示為綠色熒光；DAPI為細胞核染色，顯示為藍色熒光；Merged為TUNEL與DAPI染色結果圖像擬合；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 各組大鼠海馬神經元細胞凋亡情況的比較(×400)

2.5海馬組織凋亡相關蛋白 免疫組化分析結果顯示，模型組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3陽性細胞率明顯高于正常組(P<0.05)，Bcl-2陽性細胞率明顯低于正常組(P<0.05)，ECMO組、二甲雙胍組Bax、Caspase-3陽性細胞率明顯低于模型組(P<0.05)，Bcl-2陽性細胞率明顯高于模型組(P<0.05)，ECMO組與二甲雙胍組Bax、Bcl-2、Caspase-3陽性細胞率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

注：A為免疫組化分析海馬凋亡相關蛋白表達情況(×400)；B為Western blot分析海馬凋亡相關蛋白表達情況；ECMO為體外膜肺氧合；Bax為Bcl-2相關X蛋白；Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；Caspase-3為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶3；GAPDH為3-磷酸甘油醛脫氫酶；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖6 各組大鼠海馬凋亡相關蛋白表達的比較

2.6內質網應激相關蛋白表達量 免疫組化分析結果顯示，模型組大鼠海馬組織中GRP78、XBP1陽性細胞率明顯高于正常組(P<0.05)，ECMO組、二甲雙胍組明顯低于模型組(P<0.05)，ECMO組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

注：A為免疫組化分析內質網應激相關蛋白表達情況(×400)；B為Western blot分析內質網應激相關蛋白表達量；ECMO為體外膜肺氧合；GRP78為葡萄糖調節蛋白78；XBP1為X-盒結合蛋白1；GAPDH為3-磷酸甘油醛脫氫酶；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖7 各組大鼠內質網應激相關蛋白表達量的比較

3 討論

CA是導致人類死亡的首要原因，在我國每年約有50萬人死于CA[9]。CPR是治療CA的簡單、經濟、快速、常規手段，隨著CPR技術的發展及其質量控制的不斷完善，CA患者自主循環恢復率可達40%～60%，生存率明顯提高[10]。但由于CPR為患者的心臟和大腦僅能提供20%～40%的血流灌注，導致患者神經功能預后及生存率仍不理想，生存的患者中神經功能保持完好的患者僅占15%，生活質量受到嚴重影響[11]。CA/CPR后的腦神經保護是目前臨床上亟待解決的難題。近年來研究發現，二甲雙胍除了是國際公認的治療2型糖尿病的一線藥物外，在抑郁癥、衰老、老年癡呆等病理機制中也發揮著重要的神經保護作用，還可通過抗氧化發揮對CA/CPR后腦損傷患者的神經保護作用[12]。ECMO技術早在20世紀70年代就成功為一名接受心臟手術后的患兒提供心肺功能支持，在20世紀90年代提出ECMO輔助下的CPR為患者提供暫時的心肺支持。近年來，多項研究也證實了ECMO的應用可提高CA患者的生存率，改善患者的神經功能預后[13]。美國心臟協會指南及體外生命支持組織也認為ECMO是一種可用于CA患者的技術。但ECMO通過何種途徑減輕CA患者的腦損傷從而起到神經保護作用尚未闡明，作用機制尚未明確，影響ECMO應用于CA患者治療中的臨床進展。

Zhou等[14]的研究結果顯示，缺血預處理和缺血后處理可通過抑制海馬組織神經元細胞凋亡及調節凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達在CA大鼠的CPR中發揮神經保護作用。張宗祥等[15]發現，ERK抑制劑PD98059可通過減輕內質網應激對大鼠CA/CPR后的CIRI起到保護作用。Hu等[16]研究證實，茶多酚的應用對CA/CPR后CIRI大鼠起到腦保護作用，其機制可能與茶多酚具有較強的抗氧化活性及通過抑制神經元凋亡、增加腦內源性抗氧化能力、調節內質網應激有關。上述研究結果表明，海馬組織細胞凋亡、內源性抗氧化能力下降及內質網應激功能障礙是CA/CPR后發生CIRI的主要病理因素。本研究顯示，模型組大鼠海馬組織SOD1、SOD2、抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯低于正常組(P<0.05)，細胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達及內質網應激相關蛋白GRP78、XBP1表達明顯高于正常組(P<0.05)，均證實了上述結論。氧化和抗氧化失衡是CIRI期間神經功能缺損和高病死率的直接原因[17]。內質網應激與CIRI病理生理有關，內質網作為蛋白質折疊和合成的重要部位，對機體的穩態失衡非常敏感[18]。在缺血和缺氧時，氧化應激干擾內質網的穩態，導致錯誤折疊或未折疊蛋白的積累，觸發未折疊蛋白反應，從而促進細胞凋亡，誘發神經損傷[19]。因此，本研究通過分析ECMO對CA/CPR后大鼠海馬組織凋亡蛋白、抗氧化指標、內質網應激相關蛋白的影響，探討ECMO改善CA/CPR后大鼠腦損傷的機制。

于潔等[20]的研究結果顯示，ECMO輔助可提高CA大鼠CPR的成功率，可達87.5%。Shin等[21]證實，ECMO輔助下的CPR治療CA患者1個月和6個月的神經功能良好率(33.3%、26.7%)明顯高于常規CPR(5.0%、5.0%)，ECMO能夠提高CA/CPR患者的神經預后及生存率。在本研究中，ECMO組大鼠恢復自主循環后24 h神經功能評分明顯高于模型組(P<0.05)，提示ECMO能夠減輕CA/CPR后大鼠的神經功能損傷。ECMO除了能夠暫時為CA/CPR大鼠提供心肺支持外，還可通過保溫水箱調節大鼠體溫，降低耗氧量，起到保護重要器官的作用，從而減輕大鼠腦損傷和神經功能損傷。此外，本研究還發現，ECMO組大鼠海馬組織SOD1、SOD2、Bcl-2表達明顯高于模型組，細胞凋亡率、Bax、Caspase-3及內質網應激相關蛋白GRP78、XBP1表達明顯低于模型組(P<0.05)，表明ECMO能夠改善CA/CPR后大鼠的內源性抗氧化能力、內質網應激障礙，抑制海馬組織細胞凋亡。GRP78、XBP1均是內質網應激、凋亡和細胞存活的重要調控因子，正常情況下與內質網跨膜蛋白結合，表現出非活躍狀態，當機體由于缺血缺氧導致氧化和抗氧化失衡等各種病理因素誘導細胞內發生錯誤折疊或未折疊蛋白的積累時，其與內質網跨膜蛋白分離，引發內質網應激，處于活躍狀態的GRP78、XBP1通過促進Bax、Caspase-3表達，抑制Bcl-2表達，誘導細胞凋亡反應[22]。ECMO的應用可保證腦等重要臟器的血流灌注和氧供，還可排出血液中的CO2，緩解了機體氧化和抗氧化失衡狀態，從而減輕內質網應激障礙，抑制海馬組織細胞凋亡，發揮神經保護作用。

綜上所述，ECMO輔助下CPR能夠明顯改善CA大鼠的神經功能，其機制可能與增加海馬內源性抗氧化能力、調節內質網應激及抑制海馬組織細胞凋亡有關。