菌種固定化技術生產香芋普洱茶醋的研究

王 巖，蔣澤強，范海瓊，張小玉，袁新建，龍浩然

(江蘇食品藥品職業技術學院 a.食品學院；b.江蘇省食品加工工程技術研究開發中心，江蘇 淮安 223005)

香芋是熱帶潮濕地區普遍種植的經濟作物，是多年生天南星草本植物地下卵形至橢圓形的塊莖，藥食兩用。香芋含有豐富的蛋白質、淀粉、脂類、維生素和鈣、磷、鐵等營養物質，還含有多糖、酚類等物質，具有健脾強胃、增強機體免疫力的作用[1-2]。普洱茶是云南省特有名茶，含有多酚類物質、游離氨基酸、咖啡因、茶多糖等成分，因其獨特的風味及健康的特性備受國內外消費者和研究者的關注。普洱茶具有諸多保健功能，如降血糖、降血脂、抗衰老、抗過敏、預防癌癥等[3]。本研究嘗試把固定化發酵技術應用于香芋普洱茶醋的釀造工藝中，為生產高品質的香芋普洱茶醋提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮香芋(市售)；普洱熟茶(普爾思茅區)；白砂糖(食品級)；海藻酸鈉(分析純)；α-淀粉酶(100 000 IU/g)、α-1,4-葡萄糖水解酶(50 000 IU/g)：上海金穗生物科技有限公司；氯化鈣(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；安琪生香酵母、安琪葡萄酒用酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌(滬釀1.01)：上海迪發生物公司。

1.2 儀器設備

YXQ-30SII高壓滅菌鍋：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海理達儀器廠；WH-YC-01恒溫水浴搖床：蘇州汶顥微流控技術股份有限公司；J-832小型打漿機：上海瑞派機械有限公司；XL-60C粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；WZ-111-113手持式折光儀：浙江托普云農科技股份有限公司；PHS-3CW測定儀：北京九合儀器儀表有限公司；酒精計；酸堿滴定裝置。

1.3 檢測項目及檢測方法

糖度：手持糖度計法；酒精度：酒精計法；總酸度：酸堿中和滴定法；微生物指標：GB 4789—2016。

1.4 菌種的固定化方法

取經活化后的菌懸液與6.0%的海藻酸鈉溶液按照1∶1比例混合均勻，然后用注射器緩慢注入0.05 mol/L的氯化鈣溶液中造粒，再將固定化顆粒置于4 ℃條件下的氯化鈣溶液中保存24 h備用。

1.5 香芋普洱茶醋生產方法

1.5.1 香芋發酵前處理

香芋發酵前處理流程[4]見圖1。

香芋→挑選、清洗→去皮、切片→護色→制漿→液化(α-淀粉酶酶解)→滅酶→糖化(α-1,4-葡萄糖水解酶酶解)→冷卻

圖1 香芋發酵前處理流程

1.5.2 普洱茶發酵前處理

普洱茶發酵前處理流程[5]見圖2。

普洱茶→粉碎→浸提→冷卻→過濾

圖2 普洱茶發酵前處理流程

1.5.3 酒精發酵

酒精發酵流程見圖3。

糖化香芋料液和普洱茶浸提液(3∶1比例)混合→調整酸度和糖度→接種固定化釀酒酵母→酒精發酵→酒醪

圖3 酒精發酵流程

1.5.4 醋酸發酵

醋酸發酵流程見圖4。

酒醪→調整酒精度→接種固定化醋酸菌→醋酸發酵→過濾→澄清→精濾→殺菌→成品

圖4 醋酸發酵流程

2 結果與分析

2.1 酒精發酵階段接種固定化酵母菌的配比對酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調節料液起始pH值為4.5、酒精發酵糖度為16.0%；對料液進行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母)，接種量為10%，控制發酵溫度為32 ℃；酒精發酵時每日檢測1次酒精含量，連續發酵6 d，計6次酒精含量，考察固定化釀酒酵母和生香酵母的比例對酒精產量的影響，結果見圖5。在酒精發酵階段，固定化酵母菌的菌種比例會對酒精產量產生影響，當釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1時，酒精產量最高。

圖5 固定化酵母菌配比對酒精度的影響

2.2 酒精發酵階段的料液起始糖度對酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調節料液起始pH值為4.5，料液起始糖度分別為10.0%、12.0%、14.0%、16.0%和18.0%；對料液進行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量為10%，控制發酵溫度為32 ℃；酒精發酵時每日檢測1次酒精含量，連續發酵6 d，計6次酒精含量，考察料液起始糖度對酒精產量的影響，結果見圖6。在酒精發酵階段，發酵料液的起始糖度會對酒精產量產生影響，酒精產量隨著糖度的增加而提高，待發酵6 d后，糖度為16.0%和18.0%時的酒精產量非常接近。綜合考慮原料及后期醋酸發酵階段，選擇酒精發酵起始糖度為16.0%。

圖6 起始糖度對酒精度的影響

2.3 酒精發酵階段固定化酵母菌的接種量對酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調節料液起始pH值為4.5、起始糖度為16.0%；對料液進行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制發酵溫度為32 ℃；酒精發酵時每日檢測1次酒精含量，連續發酵6 d，計6次酒精含量，考察固定化酵母菌的接種量對酒精產量的影響，結果見圖7。在酒精發酵階段，酒精產量隨著固定化酵母菌接種量的增加而提高，發酵4 d后，酒精產量增加幅度呈減緩趨勢，繼續增加接種量，并未顯著提高酒精產量，而且還會加大固定化菌種制備的工作量。因此，選擇固定化酵母菌的適宜接種量為10.0%。

圖7 固定化酵母菌接種量對酒精度的影響

2.4 酒精發酵階段發酵溫度對酒精度的影響

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調節料液起始pH值為4.5、起始糖度為16.0%；對料液進行滅菌處理后接種已固定化的酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)，接種量為10.0%，酒精發酵階段發酵溫度依次為28、30、32、34、36 ℃；酒精發酵時每日檢測1次酒精含量，連續發酵6 d，計6次酒精含量，考察固定化酵母菌發酵溫度對酒精產量的影響，結果見圖8。在酒精發酵階段，發酵溫度低時發酵緩慢，發酵溫度高時發酵迅速，但是發酵溫度過高可能會造成酵母菌提前老化。因此，選擇發酵溫度為32 ℃。

圖8 固定化酵母菌發酵溫度對酒精度的影響

2.5 醋酸發酵階段的起始酒精度對醋酸產量的影響

待酒精發酵結束，在酒精發酵的基礎上進行醋酸發酵。醋酸發酵階段的起始酒精度依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，固定化醋酸菌接種量為10.0%，控制發酵溫度為34 ℃。醋酸發酵時每日檢測1次總酸度，連續發酵6 d，計6次總酸度，考察起始酒精度對醋酸產量的影響，結果見圖9。在醋酸發酵階段，當酒精度低于10.0%時，醋酸產量隨著起始酒精度的升高而逐漸提高；發酵4 d后，醋酸產量提高幅度呈減緩趨勢；當酒精度高于10.0%時，因酒精度過高，醋酸發酵受到抑制，醋酸產量降低。因此，選擇起始酒精度為8.0%。

圖9 起始酒精度對醋酸產量的影響

2.6 醋酸發酵階段固定化醋酸菌的接種量對醋酸產量的影響

調節醋酸發酵階段的起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量依次為6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制發酵溫度為34 ℃。醋酸發酵時每日檢測1次總酸度，連續發酵6 d，計6次總酸度，考察固定化醋酸菌的接種量對醋酸產量的影響，結果見圖10。在醋酸發酵階段，固定化醋酸菌接種量對總酸度的影響較大，接種量低會導致發酵緩慢，接種量高則產酸效率提高，但會因菌體細胞的過快生長繁殖而消耗底物，從而影響醋酸產量。因此，選擇固定化醋酸菌的接種量為10.0%。

圖10 固定化醋酸菌接種量對醋酸產量的影響

2.7 醋酸發酵階段發酵溫度對醋酸產量的影響

調節醋酸發酵階段的起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量為10.0%，發酵溫度依次為28、30、32、34、36 ℃。醋酸發酵時每日檢測1次總酸度，連續發酵6 d，計6次總酸度，考察固定化醋酸菌發酵溫度對醋酸產量的影響，結果見圖11。在醋酸發酵階段，發酵溫度低時發酵進程緩慢，發酵溫度高時發酵進程加快，但是發酵溫度過高可能會造成醋酸菌提前老化。因此，選擇發酵溫度為34 ℃。

圖11 固定化醋酸菌發酵溫度對醋酸產量的影響

2.8 固定化菌種的發酵效果與非固定化菌種的發酵效果對比

將糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，調節料液酒精發酵起始pH值為4.5、起始糖度為18.0%，對料液進行滅菌處理后，分別接種已固定化的酵母菌和非固定化的酵母菌，接種量為10.0%，設置發酵溫度為32 ℃，開始酒精發酵。每日檢測1次酒精含量，連續發酵6 d，計6次酒精含量，考察固定化酵母菌和非固定化酵母菌的發酵效果。酒精發酵結束后，在酒精發酵的基礎上進行醋酸發酵，調節起始酒精度為8.0%、發酵溫度為34 ℃，分別接種固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌，接種量為10.0%，開始醋酸發酵。每日檢測1次總酸度，連續發酵6 d，計6次總酸度，考察固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌的發酵效果。固定化菌種與非固定化菌種的發酵效果對比見圖12。不論是酒精發酵階段，還是醋酸發酵階段，固定化菌種參與的發酵效果要優于非固定化菌種參與的發酵，這主要是由于固定化發酵系統中的酵母菌或醋酸菌濃度很高，發酵過程中也會有游離態的酵母菌或醋酸菌不斷泄露，同凝膠內的酵母菌或醋酸菌共同促進產物的生成。

圖12 固定化菌種發酵與非固定化菌種發酵效果對比

2.9 香芋普洱茶醋的質量指標

2.9.1 產品感官指標

色澤棕黃，均勻一致，醋香濃郁，具有香芋風味，伴有茶香，無異味，適口性良好。

2.9.2 理化指標

總酸(以醋酸計)≥45.0 g/L；還原糖(以葡萄糖計)≥10 g/L；氨基酸態氮≥0.9 g/L。

2.9.3 微生物指標

細菌總數≤100 cfu/mL；大腸菌群≤2 cfu/mL；致病菌未檢出。

3 結論

以香芋和普洱茶為原料，采用菌種固定化技術生產香芋普洱茶醋。酒精發酵階段，起始糖度為16.0%，固定化酵母菌(釀酒酵母和生香酵母的比例為2∶1)接種量為10.0%，發酵溫度為32 ℃；醋酸發酵階段，起始酒精度為8.0%，固定化醋酸菌接種量為10%，發酵溫度為34 ℃。菌種固定化發酵效果優于菌種非固定化發酵，所得香芋普洱茶醋具有良好的質量指標。