殼聚糖-馬來酸/丙烯酰胺雙網絡型超分子水凝膠制備及應用

許雨芩，楊建軍，吳慶云，吳明元，張建安，劉久逸

（安徽大學化學化工學院安徽省水基高分子材料高性能化工程實驗室,安徽合肥 230601）

水凝膠是一種具有三維網絡結構的超親水性聚合物，表現出優異的親水性、力學穩定性和生物相容性[1]。殼聚糖(CS)是目前研究較多的抗菌性水凝膠基材，但其弱的力學韌性限制了在醫學領域的應用[2]。研究發現，利用超分子相互作用的動態特性，如氫鍵結合[3～6]、疏水締合[7]、離子相互作用[8,9]、主客體相互作用[10]和金屬-配體相互作用[11]，通過發展動態交聯網絡的方法可以提高水凝膠的綜合力學性能。Li 等[2]在CS 中原位聚合丙烯酸（AA）和丙烯酰胺（AM）單體，高溫下殼聚糖排列形成納米纖維結構。水凝膠最大伸長率超過1600%，拉伸強度高于120 kPa，壓縮應力超過120 kPa。超分子水凝膠顯示出比傳統共價水凝膠更大的優勢。這些動態交聯網絡為超分子水凝膠提供了優異的強度和良好黏附能力[12,13]。

抗生素的濫用和過度使用導致了多重耐藥細菌的出現[14]。受海洋生物貽貝的中鄰苯二酚的啟發[15,16]，單寧酸（TA）是一種含有豐富鄰苯二酚基團和鄰苯二酚衍生物的天然多酚化合物，能抑制細菌、真菌和酵母及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌等多種微生物的生長[17]，鄰苯二酚基團中含有大量的羥基，可以產生各種強相互作用而擁有超強黏附力[18]。環糊精（β-CD）是繼冠醚后第2 代超分子主體化合物，環糊精分子中因C2與C3羥基之間形成分子內氫鍵而導致其水溶性差，使之在許多應用上受到限制[19]。

本文采用原位共聚法和干法制備了羧甲基-β-環糊精（CM-β-CD），在殼聚糖水溶液中原位共聚馬來酸酐(MAH)和丙烯酰胺（AM）形成離子配位鍵。再將單寧酸包合進CM-β-CD[20]中，形成包合結構負載在殼聚糖上，設計開發一種雙網絡型超分子抗菌水凝膠。納米纖維結構的CS 與MAH-AM形成的雙網絡進一步增強了力學性能，TA-CM-β-CD 結構作為抗菌劑及其類貽貝的鄰苯二酚基團提供了優異的黏附及抗菌性能。研究了水凝膠的微觀形貌、抗菌性能和貼附性能等。該方法制備工藝簡便，為制備超分子雙網絡型抗菌水凝膠提供了思路與方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖：脫乙酰度80.0%～95.0%，黏度50～800 MPa·s，上海強順化學試劑有限公司；丙烯酰胺：化學純，天津市光復精細化工研究所；馬來酸酐：化學純，天津市光復精細化工研究所；單寧酸：分析純，上海笛柏化學技術有限公司；β-環糊精、氯乙酸（ClCH2COOH）、氫 氧 化 鈉(NaOH)、無 水 乙 醇(CH3COOH)：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過硫酸銨（APS）、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）：化學純，國藥集團化學試劑有限公司電子萬能材料試驗機：Instron5967 型，美國Instron 公司。

1.2 制備方法

1.2.1 干法制備CM-β-CD/TA 分散液：合成路線如Fig.1 所示。

Fig.1 Synthesis roadmap of CM-β-CD/TA

取6.0 g（5.28 mmol）β-CD 于研缽中研細，加入1.26 g（31.5 mmol）NaOH 均勻混合后滴入無水乙醇和水，再加入0.08 g（0.85 mmol）氯乙酸繼續研磨30 min，然后放入40 ℃烘箱中30 min，取出再次研磨30 min，如此反復進行醚化反應4 h；用乙醇洗滌2～3 次，放入60 ℃烘箱中烘干得到CM-β-CD。稱取0.1 g CM-β-CD 配制成100 mg/mL 的水溶液，超聲處理后形成穩定的水分散液。將50 mg（0.03 mmol）TA 倒入1 mLCM-β-CD 水溶液中進行超聲處理，得到TA/CM-β-CD 分散液（TA 與CMβ-CD 的質量比分別為1∶1，1∶2 和1∶4）。

1.2.2 TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 雙網絡抗菌水凝膠的制備：稱取1.0 g 馬來酸酐溶于7.5 mL 去離子水（體積分數為11.7%）中，加入0.2 g 殼聚糖分散到馬來酸酐水溶液中，攪拌過夜制成CS/MAH 水溶液（w=2%）。將2.0 g 丙烯酰胺加入到CS/MAH 水溶液中溶解均勻；在60 ℃加入1 mL TA/CM-β-CD 分散液（CM-β-CD 與CS 的質量比分別為1∶2 和1∶4）、0.24 mL MBA 交聯劑，磁力攪拌2 h；向燒杯中加入0.6 mL APS，通入氮氣，超聲處理40 min。將混合溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中，反應時間為3 h、反應溫度為40 ℃，制得TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM雙網絡抗菌水凝膠，合成路線示意圖如Fig.2，反應機理圖如Fig.3。

Fig.2 Preparation of TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM antibacterial hydrogel

Fig.3 Schematic diagrams of reaction mechanism between TACM-β-CD/CS/MAH-AM antibacterial hydrogel

得到的產物中，m(CS)∶m(CM-β-CD)∶m(TA)分 別 為4∶1∶1，4∶2∶1，8∶4∶1，8∶2∶1，相應的TACM-β- CD/CS/MAH- AM 水 凝 膠 分 別 標 記 為PAT0.5C0.5，PAT0.5C1，PAT1C0.5和PAT1C1，組 成 成 分 及 其簡稱如Tab.1 所示。

Tab.1 Compositions of reaction

1.3 測試與表征

1.3.1 FT-IR 分析：采用Nexus870 型(美國Nicolet公司) 傅里葉變換紅外光譜儀對凍干后的水凝膠樣品進行全反射光譜掃描，掃描范圍為500～4000 cm-1。

1.3.2 SEM 表征：將凍干后凝膠樣品斷面噴金處理后，采用Regulus8230 型超高分辨掃描電子顯微鏡（日本日立公司），在加速電壓3 kV 下進行觀察斷面形貌。

1.3.3 溶脹率測試：在25 ℃，分別將干質量為mo的各凝膠樣品浸沒于pH=7.4 的去離子水，充分溶脹24 h 后取出，用吸水紙拭去表面多余的水分，分別對其稱量記為mt。溶脹率（SR）計算公式為

式中：SR——凝膠溶脹度；mt——t時刻凝膠與吸附水的質量；mo——真空干燥至恒量時凝膠的質量。

1.3.4 保水率測試：在25 ℃，將水凝膠在去離子水中浸泡12 h 以上，然后將達到溶脹平衡的水凝膠快速轉移至37 °C 的烘箱中。每隔1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，36 h 及48 h 取出凝膠，測定水凝膠的質量(mp)，直至其質量不再發生變化為止。保水率（WR）計算公式為

式中：WR——凝膠保水率；mt——t時刻凝膠的質量；mp——達到溶脹平衡的水凝膠的質量。

超聲波是診斷骨盆內臟器病變最佳的輔助檢查。彩色多普勒超聲下輸卵管癌特點：①附件區臘腸型或不規則腫物，囊性伴乳頭狀回聲；②附件區卵巢形態完整；③附件區實性回聲內血流阻力指數降低[4]。超聲檢查在原發性輸卵管癌肉瘤與其他輸卵管、卵巢良惡性腫瘤的鑒別診斷方面缺乏特異性。CT和MRI在判斷輸卵管周圍臟器的浸潤、是否有淋巴結轉移及遠處轉移、指導選擇手術方式等方面有重要參考價值。然而MRI在評估腫瘤浸潤深度方面比CT更有優勢。

1.3.5 黏附性測試：依據YYT-0148-2006 標準，選擇豬皮作為生物體組織模型基材在恒溫恒濕環境中，使用INSTRON 萬能材料試驗機分別測試PAT0.5C0.5，PAT0.5C1，PAT1C0.5和PAT1C1抗菌水凝膠的搭接剪切黏合性能。黏附強度通過測量的最大載荷除以黏合面積計算得到。

1.3.6 抗菌性能測試：根據GB/T20944.1—2007《紡織品抗菌性能評價第1 部分：瓊脂平皿擴散法》測定水凝膠的抗菌性。將活化的大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）懸濁液稀釋至106 CFU/mL后涂覆在固化的瓊脂培養基上，水凝膠裁成圓形（d=20 mm）置于培養皿上37 ℃孵育24 h，觀察抑菌圈大小。抑菌帶寬度計算公式為

式中：W——抑菌帶寬度，cm；R和d——分別為抑菌圈和樣品直徑，cm。

1.3.7 溶血性測試：將紅細胞使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋25 倍后與水凝膠在37 ℃共培養1 h。將紅細胞懸液與PBS 和去離子水共培養的組，分別作為陰性對照組和陽性對照組。共培養后的紅細胞懸液用離心機在1500 r/min 的條件下離心10 min，用酶標儀測定上清液在545 nm 處的吸光度（OD）。溶血率（HR）的計算公式為

式中：ODsample，ODpositive和ODnegative——分別對應水凝膠、陽性對照和陰性對照上清液的吸光度。

1.3.8 MTT 測試：根據GB/T 1686.5—2017《醫療器械生物學評價第5 部分：體外細胞毒性試驗》測定水凝膠浸提液的細胞存活率。在96 孔板培養NIH3T3 細胞，加入水凝膠浸提液的上清液(質量濃度為10 mg/L 和20 mg/L)，并設置陰性空白對照?？字屑尤隡TT 溶液（質量濃度5 g/L 溶于PBS 中）培養4 h，吸出培養基向孔中加二甲基亞砜(DMSO)溶解甲瓚。最后測定570 nm 處孔中溶液的吸光度，同時設定630 nm 為參比波長。細胞存活率（Y）計算公式為

式中：As和Ab——分別為樣品、陰性空白對照組吸光度。

2 結果與討論

2.1 FT-IR 分析

Fig.4 FT-IR spectra of hydrogels

2.2 SEM 分析

Fig.5 為TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 和CS/MAHAM 水凝膠的SEM 圖，TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠呈現多孔互聯的微觀結構，其中Fig.5（c）為TACM-β-CD/CS/MAH-AM 復合水凝膠，Fig.5（d）為CS/MAH-AM 水凝膠。TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠與CS/MAH-AM 水凝膠的內部為均一的多孔結構，Fig.5(c)中一整塊突起為TA-CM-β-CD，旁邊有鏈段連接說明TA-CM-β-CD 被成功引入水凝膠體系中。與Fig.5（d）相比，Fig.5（c）中水凝膠微孔結構更致密，平均直徑明顯縮小。

Fig.5 SEM images of hydrogels of (a)PAT0.5C0.5, (b)PAT1C1, (c)PAT1C0.5 and (d)CS/MAH-AM

2.3 溶脹性能

Fig.6 為室溫下不同質量分數的TA-CM-β-CD 溶液對TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠溶脹性能的影響。Fig.6 可見，水凝膠在達到溶脹平衡前其質量均隨浸泡時間的增長而增加。對比PAT0.5C0.5和PAT0.5C1，在TA 含量較低的情況下，隨著CM-β-CD含量的增加，PCTC 水凝膠達到溶脹平衡時間縮短且平衡溶脹率增加，這主要是羧甲基的含量起主要作用，形成更大的微觀孔洞。當TA 含量增加時，隨著CM-β-CD 含量的增加，水凝膠達到溶脹平衡時間變長且平衡溶脹率減少，可能是由于TA 占據主導作用，TA 上的羥基與CM-β-CD、水分子、殼聚糖分子鏈上的羥基形成較強的氫鍵相互作用，阻礙了水分子和單寧酸分子進一步向水凝膠網絡滲透，導致水凝膠達到溶脹平衡的時間縮短且平衡溶脹率減小。

Fig.6 Swelling rate of hydrogels

Tab.2 Antibacterial properties of hydrogels

2.4 保水性能

TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 復合水凝膠保水性能如Fig.7 所示。由圖可知，TA-CM-β-CD/CS/MAHAM 復合水凝膠在15 h 后仍能保留15%左右的水分。對比PAT0.5C0.5和PAT0.5C1可以發現，CM-β-CD 含量的增加會降低復合水凝膠的保水性。當TA 含量增加時，復合水凝膠的保水性增加，可能是由于TA含有大量的羧酸基團，親水性更強導致復合水凝膠的保水性能增強。綜上表明，加入TA-CM-β-CD 對水凝膠的保水率有一定程度的升高或降低，PAT0.5C0.5水凝膠的樣品表現出最好的效果，在保水性能方面均優于其它幾組樣品。

Fig.7 Water retention rate of hydrogels

2.5 抗菌性能

采用大腸桿菌及金黃色葡萄球菌對水凝膠抗菌性能進行研究。與對照樣品相比，制備的水凝膠周圍形成了明顯抑菌圈。從Fig.8 可以看出，水凝膠對兩種細菌的都具有很好的抗菌效果，其中，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈寬度由0.55 cm 增大到1.75 cm，對大腸桿菌的抑菌圈寬度由0.35 cm 增大到1.5 cm。結果表明，由于單寧酸具有抗生物膜特性而具有一定的抗菌效果，TA 在CMβ-CD 中占比越高，形成的包合結構越多，水凝膠的抗菌效果越好。水凝膠對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均具有明顯的抗菌性，且對金黃色葡萄球菌的抗菌性強于大腸桿菌。證明了復合水凝膠對革蘭氏陽性（陰性）菌均具有良好的抗菌性能。

Fig.8 Antibacterial effect of hydrogels against E.coli and S.aureus

2.6 黏附性能

CS/MAH-AM 中引入的包合物TA-CM-β-CD 后，由于TA 中含有類貽貝結構中的鄰苯二酚基團賦予了其卓越的自粘性能，使得水凝膠可以黏附于各種材料的表面。如Fig.9 所示，TA-CM-β-CD/CS/MAHAM 水凝膠可以牢固地黏附在聚四氟乙烯（PTFE）、聚丙烯（PP）、合金、鐵片、玻璃和橡膠表面，而無需使用其他黏合劑。

Fig.9 Adhesion of hydrogels on different substrates

通過黏附拉伸測試計算水凝膠的黏附性能，結果如Fig.10。CM-β-CD 含量不變，隨TA 在水凝膠中含量的提高，TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠的剪切黏附強度從4.85 kPa 增加到5.57 kPa。TA 結構中類兒茶酚的結構及與CS 中含胺基團形成的共價相互作用增強了PCTC 抗菌水凝膠的黏合力。TA含量不變，CM-β-CD 含量的增加，水凝膠的剪切黏附強度沒有進一步提高，且降低到4.175 kPa?？赡苁怯捎贑M-β-CD 基團的增加，接枝到殼聚糖的亞胺鍵降低了體系中陽離子與陰離子的離子相互作用。不含有TA 與CM-β-CD 的抗菌水凝膠的剪切強度僅有0.6 kPa。這表明CM-β-CD 與TA 的加入可以顯著增強抗菌水凝膠的黏附強度。

Fig.10 (a)Stress-displacement curves of hydrogel on pigskin; (b)corresponding adhesive strength of the stressdisplacement curves

2.7 生物相容性

由Fig.11(a)可知，設置蒸餾水的溶血率為100%時，TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 抗菌水凝膠溶血率均在5%以下。隨TA-CM-β-CD 包合結構含量的增加，復合水凝膠的溶血率逐漸減小。由Fig.11(b)可知，不同含量TA-CM-β-CD 的水凝膠浸提液中培養，測得細胞存活率均在80%以上?？瞻讓φ战M的細胞存活率為101.5%±2.1%，隨著TA-CM-β-CD 用量的增加，水凝膠的細胞存活率略微減小。含有TA-CM-β-CD 的實驗組與不含TA-CM-β-CD 的對照組相比，細胞存活率相差不大。由Fig.11(a)和Fig.11(b)可知，TA 的引入會降低溶血率及細胞存活率。其中PAT1C1溶血率值最低，為0.35%?？梢哉J為，TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 抗菌水凝膠具有較好的血液相容性，可用于作傷口敷料等醫用方面。

Fig.11 Hemolysis rate of (a)hydrogel and (b)cell survival rate of hydrogel extraction liquid

3 結論

本文將羧甲基-β-環糊精嵌入單寧酸，形成包合物作為抗菌劑，利用自由基反應將殼聚糖溶解在馬來酸酐溶液中，在水溶液中與丙烯酰胺發生原位共聚反應，制備了TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 雙網絡型超分子抗菌水凝膠。對其進行FT-IR、SEM、溶脹、保水測試、抗菌測試及生物相容性測試，測試結果表明：

（1）TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 抗菌水凝膠溶脹率最高為180%。SEM 圖證明該抗菌水凝膠具有均勻孔洞結構。FT-IR 結果表明，TA-CM-β-CD 包合物成功負載在CS/MAH-AM 雙網絡水凝膠中。

（2）TA 的增加顯著增加了水凝膠的保水性能。TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 復合水凝膠在15 h 后仍保留15%左右的水分，該水凝膠具有較好的黏附性，可黏附在多種材料表面，在豬皮上的剪切黏附強度可達到5.575 kPa。

（3）隨著單寧酸含量的增加，TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠的抗菌活性增加，PAT1C1對大腸桿菌的抑菌圈寬度為1.5 cm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈寬度為1.75 cm，抗菌水凝膠溶血率均在5%以下且水凝膠浸提液中細胞存活率均在80%以上。

TA-CM-β-CD/CS/MAH-AM 水凝膠具有良好抗菌性能及細胞相容性，為其在傷口敷料和生物醫療領域的應用提供了可能。