大洋表層沉積物中甲烷代謝古菌群落的組成及分布特征

劉皓 ，許秋彤 ，王春生 ，荊紅梅

( 1. 中國科學院深?？茖W與工程研究所 中國科學院深海極端環境模擬重點實驗室，海南 三亞 572000；2. 自然資源部第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 中國科學院三亞海洋科學綜合（聯合）實驗室，海南 三亞 572000；4. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（珠海），廣東 珠海 519082；5. 海南省熱帶海洋生物技術重點實驗室，海南 三亞 572000；6. 中國科學院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301)

1 引言

海洋沉積物覆蓋約2/3的地球表面，含有豐富多樣的微生物類群。在沉積物表層，氧氣被快速消耗，隨著海洋深度的增加，絕大部分沉積物處于厭氧環境[1]。海洋沉積物中的有機質厭氧氧化的終產物甲烷，主要是由微生物驅動的甲烷循環代謝過程產生[2]。甲烷所引起的溫室效應是等摩爾的二氧化碳的34倍，貢獻了全球變暖的20%[3]，因此海洋沉積物中甲烷的代謝過程對全球氣候變化起著重要的作用。

海洋沉積物中直接參與甲烷代謝的微生物包括產甲烷菌（Methanogens）和厭氧型甲烷氧化菌（Anaerobic Methanotrophs, ANME）。產甲烷菌是形態結構各異但生理功能非常相近且極端厭氧的一類古菌的總稱，屬于古菌域（Archaea）中的廣古菌門（Euryarchaeota）[4]，廣泛分布于各類氧化還原電位很低的厭氧環境中。目前已知的主要產甲烷途徑包括：乙酸鹽裂解產甲烷途徑、氫氣還原二氧化碳產甲烷途徑和甲基化合物產甲烷途徑。厭氧型甲烷氧化菌屬于廣古菌門，能夠在厭氧的環境中將甲烷氧化成二氧化碳。ANME在冷泉、泥火山和麻坑等甲烷富集沉積物中大量存在[5-8]，也存在于熱液噴口的煙囪和巖石的厭氧層[9]。向上的甲烷流體的流速和沉積物中微生物的豐度是影響微生物甲烷氧化（Anaerobic Oxidation of Methane, AOM）過程的主要因素，甲烷流體的流速過快，微生物就不能充分氧化甲烷；微生物含量較低的沉積物，氧化甲烷的效率就較低[10]。海洋沉積物所賦存的環境條件特殊且十分復雜，具有溫度、甲烷濃度、氧濃度、微量金屬元素等多種環境因子差異。這些環境因子變量不僅影響著甲烷氧化微生物的群落結構和活性，而且還將進一步影響AOM過程[11-13]。

近年來，多采用物種或功能特異的標識記基因調查環境中甲烷氧化微生物的多樣性。16S rRNA基因是微生物生態學研究中最常用的標記基因[8,14-15]，但對產甲烷菌和甲烷氧化菌的特異性不高[3,16]。目前，甲烷代謝保守功能基因mcrA是研究甲烷代謝菌的主要功能基因[17]，其編碼甲基輔酶M還原酶并存在于所有已知的產甲烷菌和甲烷氧化菌中[18-19]。迄今，以16S rRNA基因和mcrA基因相結合來探究甲烷代謝古菌群落的多樣性和組成與基因豐度已被廣泛應用于不同海洋生境，包括加利福尼亞灣瓜伊馬斯盆地熱液區[20]、南海北部陸坡[21]和大西洋邊緣冷泉區[22]等區域。然而，大多數海洋甲烷代謝微生物類群的生態學研究都局限于單一海域，所以本研究通過mcrA基因的高通量測序分析，結合熒光實時定量PCR技術，對典型性大洋（大西洋、印度洋和太平洋）表層沉積物樣品中甲烷代謝古菌群落的組成多樣性與基因豐度進行了研究，以探究甲烷代謝古菌的生態分布特征。

2 材料和方法

2.1 樣品采集

沉積物樣品涵蓋大西洋、印度洋和太平洋三大海區（共計20個樣品，圖1）：包括南大西洋中脊樣品（A1-A9站位）；西北印度洋脊樣品（I10-I14站位）；太平洋樣品包含了馬里亞納海溝（P15-P17站位）和南海北部（P18-P20站位）兩個區域。樣品所處海區深度范圍為1 015～7 015 m（表1）。除馬里亞納海溝樣品（P15-P17，柱狀樣）由“蛟龍”號利用Push-Core采集外，其余樣品均為由抓斗或箱式取樣器采集的沉積物表層樣品。樣品采集后于-80℃保存。

圖1 各大洋采樣站位分布Fig. 1 Distribution of sampling stations in different oceans

2.2 DNA 提取、mcrA基因的PCR擴增與測序

稱取0.5 g沉積物樣品，采用PowerSoil? DNA Isolation Kit（MOBIO, USA）試劑盒對表1中20個沉積物樣品提取環境總DNA。提取操作步驟參照廠家說明書，提取后的DNA保存于-20℃。mcrA基因使用引物mcrA-F（5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3′）和mcrA-R（5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3′）擴增[16]。擴增采用20 μL反應體系：2 μL 10×Buffer，2 μL MgCl2（50 mmoL/L），1.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.5 μLmcrA-F (10 μmol/L)，1.5 μLmcrAR (10 μmol/L)，0.3 μL Taq DNA Polymerase （Invitrogen,USA），2 μL模板DNA，補超純水至20 μL。反應條件為：95℃預變性4 min；95℃變性45 s，53～52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35～40個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后，利用PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit（Invitrogen, 美國）進行純化。以等摩爾濃度的擴增子構建擴增子庫，并使用454高通量測序儀GS Junior（Roche,Switzerland）進行測序。在本研究所用的20個樣品中，I12和P19因擴增mcrA基因片段目的條帶太弱未能達到建庫要求，因此只對剩余18份樣品進行了高通量測序。

表1 沉積物樣品的采樣環境參數Table 1 Sampling parameters in different ocean sediments

2.3 實時熒光定量PCR

通過實時熒光定量PCR儀（qPCR，ABI 7500 Fast，USA）對樣本中古菌16S rRNA和甲烷代謝古菌的mcrA基因的豐度進行實時定量。古菌16S rRNA基因的引物為344F（5′-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[16]，反 應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，45個循環。mcrA基因的引物為mcrA-F（5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3′）和mcrA-R（5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3′）[16]，反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，40個循環。qPCR采用20 μL反應體系：10 μL 2×SYBR Green Premix，0.2 μL ROXⅡ，1 μL前端引物 (10 μmol/L)，1 μL后端引物(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，補超純水至20 μL。

2.4 數據分析

2.4.1 序列和多樣性指數分析

通過Roche GS Junior獲得的mcrA基因原始序列利用mothur軟件[23]（http://www.mothur.org/）分析處理序列數據。通過去除低質量、長度不正確和含有模糊堿基讀數的序列后，進行去噪處理；并與美國生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）數據庫中mcrA基因參考序列比對后，移出非mcrA基因序列，最終用97%作為Cutoff值，經過分析后得到分類操作單元（Operational Taxonomic Unit, OTU）表格。利用PAST[24]進行均勻度指數和辛普森多樣性指數（兩者均為α多樣性指數）分析，用單因素方差分析（One-way ANOVA）來比較大洋沉積物甲烷代謝古菌多樣性指數和群落結構間的差異性，p＜0.05代表具有顯著差異。將每個站位處于同一分類歸屬的OTU合并匯總，得到各站位甲烷代謝古菌種類與相對豐度。將本研究產生的mcrA基因序列的代表序列提交至NCBI數據庫，并獲得序列號（PRJNA-846686）。

2.4.2mcrA基因系統發育樹構建

用mothur軟件按97%相似度Cutoff值得到的豐度最高的30個OTU進行系統發育分析，這前30個OTU的序列豐度占到了所有樣品中序列的98%以上。將前30個OTU的代表序列上傳至NCBI Genbank數據庫中，進行Blast比對，挑選比對結果中序列同源度最高的mcrA基因序列片段，用Mega 7[25]構建系統進化樹?；跇嫿ǖ倪M化樹，確定前30個OTU的進化地位歸屬。OTU1-OTU30是本研究所獲得的大洋沉積物序列，其余序列為NCBI數據庫下載的參考序列。采用Kimura2-parameter+Gamma Distributed (K2+G)模型和Maximum Likelihood算法建樹，bootstrap值為1 000。

3 結果

3.1 各大洋沉積物甲烷代謝古菌的多樣性及群落結構

均勻度指數顯示，太平洋在所有海區中多樣性指數最低；大西洋多樣性指數跨度最大，大西洋和印度洋的α多樣性指數顯著高于太平洋（p＜0.05）（圖2）。多樣性指數趨勢與均勻度指數趨勢相似，太平洋在所有海區中最低；大西洋多樣性指數跨度最大，大西洋和印度洋的α多樣性指數顯著高于太平洋（p＜0.05）。

圖2 大洋沉積物甲烷代謝古菌群落的α多樣性指數Fig. 2 α-diversity index of the methane metabolic microbes in different ocean sediments

甲烷微菌目是本研究所發現的占比最高的類群，其次是甲烷八疊球菌目，甲烷桿菌目僅在馬里亞納海溝P16樣品中被發現，僅包含一個屬—甲烷短桿菌屬，相對豐度為0.21%（圖3）。各海區在群落結構上不具有顯著差異。

圖3 大洋沉積物樣品中甲烷代謝古菌的群落結構Fig. 3 Community structure of methane metabolic archaea in different ocean sediments

甲烷微菌目在所有樣品中具有絕對優勢（A3除外，55.97%），平均豐度達到85%以上。各海區間甲烷微菌目相對豐度存在差異。大西洋海區平均相對豐度較低（92.10%），不同站位間差異性較大（55.97%～99.98%）。印度洋海區具有95.25%的相對豐度，各站位間差異較小。太平洋兩個海區平均相對豐度最高（馬里亞納海溝98.55%；南海北部99.93%），最低的P16也有95.61%的相對豐度。本研究中甲烷微菌目由甲烷繩菌屬（Methanoline）、產甲烷菌屬（Methanogenium）和一個未知類群構成。分析顯示，該未知類群隸屬于甲烷微菌目，但與其他甲烷微菌目所屬分類單元關系較遠。因其在本研究所獲大洋沉積物樣品中的廣泛分布，暫命名為Oceanic Sediments Dominant group（OSD group）。OSD group作為所有大洋沉積物樣品中的最大類群，相對豐度在55.97%～100%之間，其中P15所獲全部序列均由OSD group構成。甲烷繩菌屬僅在印度洋（I10、I14），馬里亞納海溝（P16、P17）有極少量發現。產甲烷菌屬僅在大西洋（A2、A8），印度洋（I11、I13、I14）和馬里亞納海溝（P16）有少量被發現，相對豐度均小于0.5%（圖3）。

甲烷八疊球菌目占比第二高，各大洋沉積物中均有發現（P15除外）。大西洋海區的平均相對豐度最高，但不同站位間差異性很大。印度洋海區次之，除I10號站位（1.12%）較低外，其余站位相對豐度較平均（6.73%～8.59%）。太平洋兩海區的平均相對豐度最低。唯一未檢測到甲烷八疊球菌目的站位就隸屬于太平洋海區。馬里亞納海溝最高有4.17%的相對豐度，南海北部最高豐度僅0.07%。本研究中甲烷八疊球菌目共發現3個屬，其中甲烷擬球菌屬（Methanococcoides）占優勢。除A6（68.95%）、I11（89.15%）外，在其他站位甲烷擬球菌屬在甲烷八疊球菌目中的占比達90%以上（圖3）。甲烷葉菌屬（Methanolobus）僅在大西洋和印度洋的部分站位中被發現，最高相對豐度僅1.04%（A6）。唯一被發現的厭氧甲烷氧化菌ANME-3類群的相對豐度則更低，僅在A1、A9和I13站位樣品中被發現。其在印度洋相對豐度最高，但也僅有0.46%，大西洋相對豐度均低于0.1%（圖3b）。

3.2 各大洋沉積物甲烷代謝古菌進化地位及系統發育樹

系統進化分析顯示，占比最高的前30個OTU分屬于甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和甲烷桿菌目（Methanobacteriales）（圖4）。僅有OTU15隸屬于甲烷桿菌目的甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）。甲烷八疊球菌目則有3個屬被檢測到：OTU10、OTU12、OTU19、OTU23隸屬于甲烷葉菌屬；OTU3、OTU6、OTU13、OTU18、OTU20、OTU24、OTU25、OTU30隸屬于甲烷擬球菌屬。甲烷微菌目包含的OTU數目最多，共16個，分屬2個屬和1個分類地位不明晰的類群。OTU14屬于甲烷繩菌屬；OTU26、OTU29隸屬于產甲烷菌屬。其余13個OTU屬于一個進化地位不明晰的類群。這13個OUT聚為一類，其置信度高達95%（圖4），但是沒有任何已知序列與該類群有超過90%的相似度。系統發育樹顯示，該類群隸屬于甲烷微菌目，與產甲烷菌屬分支關系較近。該類群與產甲烷菌屬歸為一個大支的置信度僅有36%?，F有研究尚不能對該類群做出明確的進化地位界定。

圖4 基于甲烷代謝古菌mcrA基因核酸序列構建的系統進化樹Fig. 4 The phylogenetic tree based on nucleic acid sequence of mcrA gene of methane metabolizing archaea

3.3 大洋甲烷代謝古菌的豐度

大洋沉積物樣品中古菌16S rRNA基因豐度（濕重，下同）范圍為1.38×106～3.07×107copies/g，基因平均豐度為8.81×106copies/g。其中，大西洋古菌16S rRNA基因平均豐度為3.30×106copies/g，低于印度洋（1.37×107copies/g）和太平洋（1.30×107copies/g）。馬里亞納海溝沉積物樣品中古菌16S rRNA基因平均豐度（3.32×106copies/g）低于南海北部（2.26×107copies/g），且隨著沉積物深度增加呈降低趨勢。所有樣品中，南海北部（P20）的古菌16S rRNA基因豐度最高，而馬里亞納海溝（P17，底層）豐度最低（圖5）。

圖5 大洋沉積物中的古菌16S rRNA和甲烷代謝古菌mcrA基因的豐度分布Fig. 5 Distribution of abundance of the archaeal 16S rRNA gene and methane metabolic mcrA gene in different marine sediments

大洋沉積物中mcrA基因豐度范圍是1.32×103～1.03×105copies/g，平均豐度為1.04×104copies/g。各大洋之間，大西洋平均豐度最高（1.95×104copies/g），太平洋次之（6.30×103copies/g），印度洋最低（6.16×103copies/g），印度洋與太平洋無顯著性差異。其中，大西洋各站位豐度具有明顯差異，A1顯著高于其他站位（p＜0.01），因此大西洋是mcrA基因豐度跨度最大的海區。太平洋各站位之間基因豐度差異性相對較小，馬里亞納海溝略高于南海北部海區。馬里亞納海溝沉積物樣品由淺及深的基因豐度呈先降后升的趨勢（圖5）。

4 討論

4.1 甲烷代謝古菌的群落組成

α多樣性指數顯示，太平洋在所有海區中最低；大西洋多樣性指數跨度最大，這可能是由于樣品所采集的平均深度所導致。在太平洋的平均采樣深度（4 914 m）遠高于大西洋（2 705 m）和印度洋（3 136 m），水深越深，到達沉積物表層可被微生物利用的有機物越少，從而導致群落多樣性減少。這一趨勢進一步證實了深度是影響微生物多樣性的主要因素之一[26]。同時由于有機物通量的減少而導致電子受體（氧、硝酸鹽等）消耗速度變慢，使得能夠高效利用這些受體的特定甲烷代謝古菌群落在大洋沉積物中占優勢?？傮w而言，所有沉積物樣品的均勻度指數最高值為0.35，這表明甲烷代謝古菌不同類群的空間分布差異較大，可能存在著某個或某幾個占據大洋沉積物絕對優勢的甲烷代謝古菌類群。

本研究中產甲烷菌的甲烷微菌目在大洋表層沉積物中占有絕對優勢，平均豐度達到95%以上。已有研究表明產甲烷菌在太平洋東岸以甲烷擬球菌屬的Methanococcoides burtonii和Methanococcoides alaskense為主[27-28]，在西岸以甲烷微菌目和甲烷八疊球菌目為主[29-30]；南海南部陸坡表層沉積物以甲烷桿菌目為主[31]。這表明了多樣的產甲烷菌和潛在的甲烷產生途徑廣泛存在于深海沉積物中[32]，該生境相對于熱液、冷泉和近岸河口更不易受到到環境因素（如溫度、鹽度和pH等）的影響，導致大約有10%的有機物被產甲烷菌轉化成CH4[33]。此外，不同大洋沉積物中的甲烷代謝古菌群落結構單一。這可能是因為大洋沉積物不具有高甲烷底物的環境特征，且一般營養物質偏低，使得適應此種環境的甲烷代謝古菌的類群組成較為單一。因而與有大量甲烷氣體溢出的冷泉區中的類群存在明顯不同，形成了源自生境條件的群落差異。

4.2 大洋沉積物古菌的基因豐度

本研究結果表明，大洋沉積物樣品中古菌16S rRNA基因平均豐度相較于北冰洋（格陵蘭島東岸）、北大西洋、地中海[34]和南海地區（海馬冷泉、西沙海槽、F冷泉）的表層沉積物[35]低1～2個數量級。這可能是因為本研究中的樣品采集自寡營養的大洋沉積物，且深度較深所造成的。此外，本研究中馬里亞納海溝的沉積物柱狀樣中古菌的基因豐度與采樣深度呈負相關，這與小笠原海溝（位于馬里亞納海溝北部）的研究結果趨勢相一致[36]，進一步證明了有機物分布的差異可以影響古菌16S rRNA基因豐度分布。

大洋沉積物中檢測到的mcrA基因豐度顯著低于南海槽冷泉區[37]、海馬冷泉區[13]、日本海冷泉區[38]和沖繩熱液區[39]。這可能是因為冷泉區和熱液區具有包含甲烷在內的大量氣體不斷涌出，為周邊甲烷代謝古菌提供碳源與能源，促進了mcrA基因豐度的顯著增高。

4.3 OSD group在大洋沉積物的分布及近緣類群

OSD group是本研究發現的一種相對豐度占優勢的甲烷代謝古菌類群。與NCBI數據庫的比對結果顯示，其序列與目前已發表的序列最高相似度都低于90%。NCBI數據庫中與OSD group相似度較高的序列，除已獲得基因組全序列的CP002117來源于近海油田外，其余8個所處的生境均為厭氧環境。CP002117源自人工培養的甲烷盤菌屬菌株（Methanoplanus petroleariustype strain）（SEBR 4847T）[40]。該菌株嚴格厭氧，屬于CO2/[H]型產甲烷菌，其原始生境與本研究中的大西洋站位處于同一緯度，距離較近。

本研究顯示，OSD group可能廣泛分布于大洋沉積物中，在所有樣品中其相對豐度均過半。甲烷代謝古菌中單個類群具有如此高占比的現象在冷泉沉積物表層中已被報道過[13]，其獨特的生境條件造就了如此單一的群落結構。但大洋沉積物并不具備類似冷泉的條件，因此現有研究還不能找到解釋此現象的有力證據，該類群在大洋沉積物生境中的生態功能還需進一步探究。

5 結論

（1）因大洋沉積物具有寡營養特征，特別是甲烷底物偏低，其深海表層沉積物中廣泛存在結構單一的甲烷代謝古菌群落，以及豐度顯著低于其他海洋生境的古菌和甲烷代謝古菌。

（2）甲烷微菌目是大洋表層沉積物中的主要甲烷代謝古菌類群，其中以一簇未知類群（OSD group）占優勢；該簇與已知序列均不具有較近親緣關系，進化地位尚不明晰，還需要進一步研究。