蛋白質組學分析中蛋白質快速酶解方法的研究進展

關致穎， 潘建章,2， 方 群*,2,3

(1.浙江大學化學系，浙江杭州 310058；2.浙江大學杭州國際科創中心,浙江杭州 311200；3.浙江大學激發態材料浙江省重點實驗室，浙江杭州 310007)

1 引言

細胞是生命活動的基本單位，生物體內組成不同、功能各異的多種細胞中時刻進行著復雜的生命活動[1]。蛋白質是細胞內功能的直接執行者，蛋白質組學層面的差異標志著細胞功能的差異[2]?；虮磉_過程從DNA、mRNA到蛋白質，存在轉錄水平、翻譯水平以及翻譯后水平三個層次的調控，這使得組織中mRNA豐度與蛋白質豐度的相關性大大降低。蛋白質復雜的翻譯后修飾(Post-Translation Modification,PTM)等過程均不能從其基因編碼序列中預測，只能從功能蛋白的層面展開分析。因此，從蛋白質組學層面展開深入研究具有重大意義。

質譜(Mass Spectrometry,MS)作為一種靈敏度和分辨率極高的分析方法，可在無標記的情況下直接測定樣品離子的質量數與電荷數之比(質荷比，m/z)。20世紀80年代末,基質輔助激光解吸電離(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)[3]和電噴霧電離(Electron Spray Ionization,ESI)[4]兩種軟電離技術的誕生推動了生物質譜的快速發展，可以實現對多肽等生物大分子快速、精確的測定[5]?；谫|譜技術的蛋白質組學分析方法主要有自上而下(Top-down)[6 - 8]和自下而上(Bottom-up)[9 - 13]兩種策略。自下而上的蛋白質組學分析能夠對復雜的生物樣品提供足夠的鑒定深度和廣度，已成為主流的蛋白質組學方法之一，廣泛應用于蛋白質的鑒定及其PTM分析中。在以液相色譜-質譜(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)分析系統為基礎的自下而上鳥槍法(Shotgun)蛋白質組學分析中，蛋白質需要在進入LC-MS分析系統前被蛋白酶消化成分子量更小的肽段。常規的蛋白質組學前處理操作主要包括以下步驟：首先，使用細胞裂解劑破碎細胞膜，釋放其中的蛋白質；其次，加入還原劑，使蛋白質中的二硫鍵斷裂并形成半胱氨酸殘基；之后加入烷基化試劑將半胱氨酸殘基烷基化使其無法再次形成二硫鍵，從而破壞蛋白質的空間結構，將其展開為長鏈，使切割位點充分暴露。上述每個步驟的時間通常都不到1 h。第四步是加入胰蛋白酶，將蛋白質長鏈消化成肽段，這一過程通常要求37 ℃下過夜反應，反應后加入甲酸調節體系酸堿度并終止反應。樣品經脫鹽處理后，送入LC-MS系統進行分離和檢測，單個樣品的分離檢測時間通常在2 h以內。顯然，在整個蛋白質組學分析過程中，過夜的胰蛋白酶消化是最關鍵也是最耗時的一步，耗時數小時以上的酶解反應制約了蛋白質組學前處理操作的通量和效率。酶解反應的完全性和專一性對于蛋白質及其序列的鑒定起到決定性的作用，酶解程度受到酶的種類和活性、反應體系酸堿度(pH值)、溫度、時間等因素影響。探索能夠顯著加快胰酶消化速度的方法能夠顯著提高蛋白組學分析的效率，以應對大規模、高通量的分析需求。以下，本文將從引入額外能量、縮小反應體系體積、改變酶試劑形態三種策略來介紹近年來蛋白質快速酶解研究工作的進展。

2 引入額外能量的快速酶解策略

蛋白質的酶解反應效率取決于酶分子的活性、蛋白質切割位點的暴露程度、兩種分子間發生碰撞及相互作用的幾率等因素。向蛋白質酶解體系提供額外的能量，能夠向體系提供充足的反應溫度，提升酶分子的活性，促進蛋白質分子中各類化學鍵的振動，幫助蛋白質分子暴露切割位點并與活躍的酶分子相結合，從而顯著加快蛋白質酶解反應的進程。

紅外光是波長在770 nm到1 mm之間的電磁波，紅外激光可用于許多生物學過程的調節和疾病的治療，其中發射波長約為800 nm的近紅外激光應用尤為廣泛[14 - 18]。這種近紅外激光即使在高功率和長時間照射下也可以很容易地穿透水且幾乎沒有能量損失，相較于其它激光輻射而言，對生物組織造成不可逆損傷的概率明顯降低。如果激光功率足夠高，它能夠加速熱量積累并提高生物過程中的組織溫度。除了光熱效應外，高能近紅外輻射還可以激發組織內有機成分化學鍵的振動，提高分子水平的反應活性。對于蛋白質的酶解反應而言，近紅外激光的熱效應能夠幫助胰酶維持在適宜的反應溫度且不損傷蛋白質和胰酶的活性，對蛋白質分子中的N-H、C-O、C-N鍵振動的促進作用有可能幫助蛋白質暴露更多的胰蛋白酶切割位點，從而有效提升酶解反應的效率。

2008年，Wang等[19]首次將紅外光用于提升胰蛋白酶消化蛋白質的效率。他們將蛋白質∶胰蛋白酶=40∶1(w/w)的混合溶液置于密封透明的離心管中，在250 W紅外燈照射下進行酶解反應，通過熱電偶溫度計維持溶液溫度在37 ℃。結果顯示，該方法可將牛血清白蛋白(Albumin from Bovine Serum,BSA)和肌紅蛋白(Myoglobin,MYO)的消化時間縮短到5 min，通過MALDI-TOF MS鑒定序列覆蓋率分別為69%(BSA)和90%(MYO)，明顯優于傳統方法38%(BSA)和69%(MYO)的消化結果。2010年，Yao等[20]使用功率為5 W、波長為808 nm的光纖耦合二極管紅外激光照射蛋白質和胰酶的混合溶液來加速酶解反應的進程。如圖1a，紅外激光器照射在密封的透明離心管或不銹鋼 MALDI 靶板上，輻照度約為25.5 W/cm2。結果顯示，使用紅外激光照射能夠將離心管內的肌紅蛋白酶解反應縮短到幾十秒，且所得序列覆蓋度略高于過夜酶解12 h的樣品。對于MALDI靶板上的樣品，紅外激光照射可將酶解過程縮短至5 s，所得蛋白質序列覆蓋度和離心管內溶液樣品基本相同。實驗顯示紅外激光對十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)膠內蛋白質酶解效率也有提升作用，但不如離心管內溶液反應的效果，可能是由于808 nm的紅外激光更容易穿透含水量高的樣品。文章使用該方法進行大鼠腦提取物的前處理，酶解時間為1 min，用LC-MS/MS鑒定，得到728條肽段和134個蛋白質。為探究激光熱效應對反應的實際作用，他們將離心管置于冰水浴中并照射激光，以控制溶液在反應過程中的溫度。結果顯示，冰水浴中樣品所得的BSA序列覆蓋度(26%)低于不加冰水浴的結果(42%)，說明紅外激光的熱效應是促進蛋白質酶解的一個重要因素，但與此同時也存在其他作用機理。在此基礎上，2011年Zhang等[21]將紅外激光與固定化酶反應器(Immobilization Enzyme Reactor,IMER)聯用來提高蛋白質酶解的效率。激光輔助IMER蛋白酶解系統如圖1b所示，IMER通過胰蛋白酶丙烯?；驮凰嗑酆蟽刹椒磻w固定在毛細管中，長度約為1 cm。實驗使用發射波長為808 nm、功率為5 W的光纖耦合二極管紅外激光器，光纖透鏡和IMER之間的距離固定為10 cm。通過注射泵將蛋白質溶液注入固定有IMER的毛細管，蛋白質消化過程可在60 s內完成，使用MALDI-TOF MS鑒定得到BSA的序列覆蓋率為33%，細胞色素c(Cytochrome c,Cyt-c)的序列覆蓋率為73%，β-酪蛋白(Beta-Casein,β-casein)的序列覆蓋率為22%，與常規溶液中反應14 h所得蛋白質序列覆蓋度基本相同，顯著高于僅使用IMER的效果。蛋白質N-末端的靶向分析有助于闡明成熟蛋白質N-末端的起始位點和翻譯后修飾。Li等[22]將紅外激光輔助蛋白質酶解的方法用于蛋白質的N-末端分析。實驗結果顯示，兩種蛋白酶解方法所得的4種標準蛋白的肽段數量和序列覆蓋率基本相同，而紅外激光輔助酶解的方法可以增強蛋白質中N-末端肽的釋放。與傳統的過夜消化相比，激光輔助消化的方法從小鼠肝臟中識別出的N-末端肽數量提高了28.3%，消化時間成本從過夜縮短到40 s。

微波是波長在0.01～1 m、頻率在0.3～30 GHz之間的電磁輻射。作為常見的熱源之一[23]，微波加熱的原理是促進物質內部極性分子的高頻往復運動，它無需熱傳導過程即可使物質內外均勻地受熱升溫，這使得其加熱效率遠高于常規熱源。將微波加熱運用于化學反應當中，可以有效地提升反應的產率和效率[24 - 32]。對于蛋白質酶解反應而言，選擇適當的微波功率及加熱時長，可以顯著加速酶解反應的進程。

2002年，Pramanik等[33]使用最大功率為300 W、具有溫控功能的單束微波發生器產生微波，實現了微波輔助的溶液內蛋白質快速酶解。實驗使用胰蛋白酶∶蛋白質=1∶25(w/w)的比例處理細胞色素c、泛素、溶菌酶、肌紅蛋白和干擾素-2b，反應溫度設定在37 ℃，微波照射10 min，使用 MALDI-TOF MS或ESI MS技術進行分析。與傳統方法所需的數小時相比，微波輔助可以在數分鐘內完成蛋白質的消化。為了研究微波照射加速蛋白質酶解的機制，實驗在不同的微波溫度設置下進行干擾素-2b的酶解，并在不同時間點采集反應樣品，結果顯示，溶液溫度快速升高到60 ℃以上將大大增強酶解反應效率。為進一步驗證快速升溫是否對酶解反應的加速有重要作用，在沒有微波照射的情況下將反應混合物放入預熱至60 ℃的加熱塊中，所測得的酶解情況與微波實驗獲得的結果相似，說明反應溫度的快速升高是微波加速酶解反應的重要原因之一。Lin等[34]研究了在不同種類溶劑系統中進行微波輻射加速蛋白質酶解的反應情況。有機溶劑具有促進蛋白質變性的作用，在傳統酶解實驗中，加入甲醇、乙腈等有機溶劑雖然能促進蛋白底物的變性，但同時會使胰蛋白酶失去活性。使用600 W微波爐產生微波輻射，將肌紅蛋白、細胞色素c、溶菌酶和泛素作為底物，胰酶∶蛋白質比例為1∶25(w/w)，反應時間為10 min。結果顯示，在微波作用下，乙腈、甲醇和氯仿中的胰酶酶解反應消化效率和所得蛋白質的序列覆蓋度均較常規酶解反應有顯著提升。這些結果表明，微波輻射能夠在一定程度上提高蛋白質酶解體系對有機溶劑的耐受性，使得酶解效率進一步提升。Sun等[35]使用850 W微波爐產生微波，將200 μL 1 mg/mL BSA溶液置于0.6 mL離心管中，加熱時在離心管旁放置1 000 mL水吸收多余能量，微波加熱時間為1 min。實驗比較了不同的反應條件的結果，說明對于快速酶解反應，蛋白質還原步驟較為重要而烷基化步驟可以省略。對于凝膠內蛋白質，將樣品放于1.5 mL離心管微波加熱5 min可得到比常規實驗更好的消化效率。在使用BSA對實驗條件進行優化后，他們將該系統應用于人尿液提取蛋白和酵母裂解產物這兩種復雜樣品中，能夠分別在6 min 或25 min內完成溶液中(人尿液提取蛋白)或凝膠中(酵母裂解物)的蛋白質混合樣品前處理，獲得了與常規過夜酶解等效或更佳的反應效果，顯示了微波輔助酶解技術在復雜生化樣品分析中的應用潛力。Zhao等[36]開發了一種集成化的蛋白質樣品制備方法imFASP，將原位過濾器輔助的樣品預處理方法和微波輔助的胰酶酶解方法結合，可在1 h內高效地處理微克至納克級的復雜蛋白樣品。如圖1c所示，首先，將溶解在8 mol/L尿素中的蛋白質上樣至截留分子量為10 kDa的過濾器上，然后進行原位蛋白質預濃縮、變性、還原、烷基化和微波輔助胰蛋白酶消化。與傳統溶液中樣品前處理的鑒定結果(1 952個蛋白質和18 645個肽段)相比，imFASP方法從45 mg大腸桿菌蛋白質提取物中鑒定到的結果(2 215個蛋白質，23 012個肽段)更高，且樣品前處理通量提高了14倍。當將大腸桿菌細胞裂解物的量降至50～500 ng的水平時，imFASP方法相對于傳統溶液過夜酶解的方法，對蛋白質和肽的鑒定數分別提高了30%和44%，說明imFASP方法在微量蛋白質組樣品的分析方面有獨特的優勢，有望成為高效、高通量的微量蛋白質組分析方法。

圖1 引入額外能量的蛋白質快速酶解系統[20,21,36]Fig.1 Rapid enzymatic proteolysis systems based on introducing additional energy[20,21,36]

超聲波作為一種波長很短的機械波，也被用于加速蛋白質的酶解反應。2005年，Lopez-Ferrer等[37]首次使用高強度超聲探頭進行蛋白質酶解。2007年，Rial-Otero等[38]報道了一種使用基于超聲反應器的加速蛋白質酶解動力學的新方法。他們將兩種不同的超聲發生裝置——超聲反應器和超聲探頭分別用于蛋白質的酶解反應中，建立了超聲波輔助蛋白質酶消化(Ultrasonic-assisted Protein Enzymatic Digestion,USAPED)分析方法，通過MALDI-TOF MS鑒定蛋白質的肽指紋圖譜。作者優化了胰蛋白酶/蛋白質比例、超聲時間、超聲波振幅、蛋白質底物濃度等一系列反應條件。結果顯示，兩種超聲發生裝置最佳的胰蛋白酶/蛋白質比例和能夠檢出的最低蛋白質濃度基本相同，所用胰蛋白酶的量高于常規酶解反應體系的用量。在同樣使用50%超聲振幅的情況下，超聲探頭消化蛋白質所需的時間(60 s)比超聲反應器(120 s)更短，但使用超聲反應器獲得的MALDI-TOF MS譜圖更清晰，標準偏差更小。此外，超聲反應器有六個樣品通道，樣品前處理的通量更高，更加適用于小體積樣品，而超聲探頭一次只能處理一個樣品，易造成微量樣品的攜出損失。

3 縮小反應體系體積的快速酶解策略

微反應體系具有不同于常規毫升至微升級體系的反應特征和獨特優勢，在微米級反應體系(如微液滴或微通道)中微尺度效應凸顯，物質傳質傳熱加快，反應的效率會得到顯著的提升。微米級的微液滴可以通過電噴霧、微流體、紙噴霧等多種方法產生[39 - 45]。微液滴體系被廣泛運用于加速各種類型的單相或雙相有機反應，這些反應往往動力學過程緩慢，在常規大體積反應中需要加入特定的催化劑[46 - 49]。微液滴反應過程結合質譜檢測也被用于研究快速反應動力學，推進化學合成、納米材料合成等方面的研究[50 - 53]。微液滴內反應速率顯著提升的確切原因目前尚未完全明確，但通常推測是與微尺度體系內的各種因素如液滴大小、表面電荷、溶劑組成、液滴蒸發等[54,55]有關。微液滴除了在有機合成方面發揮重要作用外，水性微滴能夠提供與生命體系兼容的環境，故其在促進生化反應方面也有很大潛力。

2020年，Zhong等[56]使用電噴霧質譜噴霧過程中產生的微液滴來實現蛋白質的快速酶解。如圖2a所示，在室溫下將10 μmol/L肌紅蛋白和5 μg/mL胰蛋白酶的5 mmol/L NH4HCO3溶液通過自主搭建的± 3 kV高壓噴霧裝置噴射形成直徑9 μm、體積3 pL左右的液滴，液滴噴霧口和質譜口之間的距離約為2 cm，毛細管周圍使用干燥N2作為鞘氣，質譜入口毛細管溫度始終保持在275 ℃，電壓保持在0 V，實驗在不到1 ms的時間內獲得100%的肌紅蛋白序列覆蓋率。將相同的溶液置于37 ℃反應14 h，使用商品化電噴霧電離源產生直徑約為60 μm的大液滴進行噴霧和質譜分析，得到的肌紅蛋白序列覆蓋度為60%，說明液滴尺寸對反應效率有顯著的影響。他們還研究了微滴質譜法中蛋白質酶解適宜的pH范圍。當pH小于4時，微滴質譜法促進酶解的程度會受到抑制，測得蛋白質序列覆蓋度約為40%；當pH高至11時，微滴質譜法仍可完全消化合成肽。該方法被用于治療性抗體曲妥珠單抗(約148 kDa)的序列分析，得到輕鏈100%、重鏈85%的序列覆蓋率，證明了其在藥物開發中的應用潛力。

4改變酶試劑形態的快速酶解策略

生物酶催化效率高、專一性強,通常在常溫、常壓等生物適宜的條件下發揮催化作用[57]。然而，當離開細胞及其特定環境,酶分子難以長時間保持活性或進行重復利用。固定化酶是指通過某種方法將酶固定于固體載體上或限制于一定區域內，在保證其催化能力的基礎上提高酶試劑的穩定性和重復利用率[58,59]，被廣泛應用于醫藥、食品、能源、環境等領域。固定化酶提供了一個局部高濃的酶環境，能夠有效加速蛋白質酶解反應動力學。常見的固定化酶載體有玻璃、膜、聚合物、磁珠、凝膠、多孔硅膠、多孔整體式材料等，固定方法也多種多樣，如吸附法、包埋法、共價結合法、交聯法等[60 - 62]。

Kosuke等[63]通過使用毛細管內固定化酶的方法來實現少量細胞的在線高效蛋白質組樣品前處理(In-Line Sample Preparation For Efficient Cellular Proteomics,ISPEC)。ISPEC分析系統如圖2b，將2 μL HeLa細胞懸液滴到玻璃板上，將相同體積的裂解液滴在另一塊玻璃板的同一位置上，依次吸取空氣500 nL、裂解液2 μL、空氣500 nL、HeLa細胞懸液或細胞培養上清液，空氣500 nL。使用帶有電荷耦合器件(Charge Coupled Device,CCD)相機的顯微鏡對細胞進行計數，確定收集在采樣毛細管中的細胞數量。之后，使用PicoClear聯結器將采樣毛細管連接到填充有固定化胰蛋白酶的反應毛細管和色譜柱，用注射泵以5 μL/min的流速推動水溶液進入毛細管，使得毛細管中收集的細胞與裂解液混合而裂解，再將流速更改為1 μL/min，推動溶液與固定化胰蛋白酶微球接觸使蛋白質酶解，最終將酶解所得的肽段捕獲在液相色譜柱的入口端，整個酶解和進樣過程約1 h。將所得的裝有樣品的毛細管色譜分析柱連接到液相泵上，使用含有5%乙腈和0.1%甲酸的水溶液作為流動相進行30 min的液相分離。為避免樣品間的交叉污染，每次分析均需更換固定化胰蛋白酶柱和色譜分析柱。使用經過優化的ISPEC方法和nano-LC-MS分析方法，他們分別從100個、10個和單個HeLa細胞中鑒定到了1351、351和60種蛋白質。該系統針對少量哺乳動物細胞樣品展開方法設計和優化，降低了樣品制備過程中的損失，提高了固定化胰蛋白酶消化的穩定性和效率。

圖2 縮小反應體系體積和使用固定化酶的蛋白質快速酶解系統[56,63 - 65]Fig.2 Rapid enzymatic proteolysis systems based on reducing reaction system volume and using immobilized enzyme reactors[56,63 - 65]

Shen等[64]比較了采用固定化胰蛋白酶(Immobilized Trypsin,IM)和游離胰蛋白酶(Free Trypsin,FT)兩種方法的酶解結果，同時系統地分析了IM相對于FT的作用區別以及IM固定基質的引入對蛋白質裂解機理或選擇性的影響。如圖2c所示，分別使用了胺基官能化(IM-N)或羧基官能化(IM-C)的固定化酶磁珠以及FT來消化大腸桿菌蛋白質組樣品。與FT相比，IM在其消化蛋白的過程中沒有特殊的選擇性，對于位置不同、功能不同、豐度不同的蛋白都可以較好地進行鑒定。IM-N方法(用時15 min)和FT方法(用時12 h)都可以從小鼠腦蛋白質組中鑒定出9000種蛋白質。該工作建立了使用固定化酶進行消化的高通量自下而上蛋白質組學工作流程：蛋白質樣品預處理(包括蛋白質變性，還原和烷基化)用時40 min，IM-N消化用時15 min，肽段脫鹽和凍干用時1 h，毛細管區帶電泳質譜(Capillary Zone Electrophoresis,CZE-MS/MS)分析時間為30 min，數據分析用時30 min，整個分析流程總時長約3 h，從小鼠腦蛋白質組中識別出1000多種蛋白質和6000多種肽，具有良好的定性和定量重現性。

Atacan等[65]使用熱溶劑法制備了Fe3O4磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)，并開發了一種新方法將胰蛋白酶共價固定在單寧修飾的MNP上，表征了所得納米粒子的形貌、結構和磁性。Fe3O4納米粒子具有優良的藥物相容性和超順磁性，非常適用于固定化酶的研究，但裸露的Fe3O4納米粒子通常穩定性和分散性較差，因此需要開發表面修飾方法來獲得穩定且更具生物相容性的Fe3O4納米粒子。單寧酸是一種天然的多酚分子，廣泛存在于多種植物中，葡萄糖作為中心核通過酯鍵與十個沒食子酸基團相連，其大量羥基結構易與生物聚合物相互作用，故可用作固定化酶結構的結合涂層。實驗利用多酚的pH依賴性氧化反應，通過升高pH在單寧修飾納米顆粒上生成醌基，利用席夫堿反應或Michael加成反應將胰蛋白酶共價固定在單寧修飾的Fe3O4MNPs上(圖2d)。室溫下，Fe3O4MNPs的飽和磁化值為60.18 emu/g，而單寧修飾的Fe3O4MNPs和固定有胰酶的單寧修飾Fe3O4MNPs的飽和磁化值分別為57.82 emu/g和55.16 emu/g，這表明單寧涂層和胰蛋白酶固定良好。他們使用BSA作為樣品來表征固定化酶效果，分別在1 min、5 min和15 min內進行了BSA的酶解，并且在微波輔助下將酶解過程縮短到15 s，使用MALDI-TOF MS鑒定到39個特征肽段，在1 min的消化時間下獲得了84%的蛋白質序列覆蓋率。

2020年，Wei等[66]基于玻璃芯片研制了一種集成了固定化酶反應器(IMER)的一體化蛋白質預處理微流控系統。玻璃芯片由三個入口通道和兩組蛇形通道組成，可使蛋白質溶液、還原劑和烷基化試劑同時注入芯片通道，保證反應液在線高效混合和充分反應。IMER通過硫醇-烯點擊化學反應制備，經檢測2個月內IMER酶活性降低13.8%，體現了IMER系統的穩定性和重復利用的能力。在此基礎上，該研究組[67]于2021年發展了通過微流控芯片集成反相色譜、IMER和分子印跡整體柱的樣品處理系統，實現在線蛋白質分離、變性、消化和多肽富集。該微流控系統完整處理一組樣品的時間(約9.6 h)短于傳統方法(約13.3 h)。2022年，該研究組[68]報道了基于微流控系統的分子印跡聚合物(MIP)和IMER相結合的富集策略，提高了質譜鑒定N-肉豆蔻?；牡乃?，從MCF-7細胞提取的蛋白質混合物中鑒定出1 296個蛋白質和5 670個肽段，包括71個肉豆蔻?；鞍缀?8個肉豆蔻?；?。

5 總結與展望

隨著人們在生物醫學領域的認識和研究不斷深入，少量細胞乃至單個細胞水平的蛋白質組學研究引起了廣泛關注[69 - 71]?；邙B槍法的傳統蛋白質組學前處理流程較為復雜且耗時，如何顯著提升蛋白質酶解速率是一大挑戰。紅外光輔助酶解策略通常用于離心管內數十微升體積的樣品，蛋白質底物濃度較高，可將蛋白質酶解時間縮短至30 s～5 min。紅外激光輔助的酶解系統裝置簡單，操作方便，易于集成，但它要求反應器為敞開式或者基于紅外透過特性，方便光線照射到樣品溶液。紅外激光器的性質決定了它更適合于流動式的反應體系，對于大規模批式樣品，紅外激光器產生的激光難以同時均勻作用于每個反應單元，因此需要組裝運動元件控制其在不同反應單元上方移動和定位，或采用多個紅外激光器構建反應器陣列。已報道的微波輔助酶解策略同樣用于離心管內數十微升體積的樣品，可將蛋白質酶解時間縮短至30 s～10 min。使用微波爐產生微波的方法非常適用于批量樣品同時反應，操作簡單高效，但是微波爐本身難以集成到自動化微量樣品前處理模塊中。另外，高功率的紅外激光和微波在操作中都具有一定的危險性。超聲輔助酶解策略適用于數十微升樣品，反應時間通常在1～20 min，操作簡單，但超聲波引起的振動對液體造成的擾動較大，不適用于微液滴原位反應體系。另一種基于微尺度效應的快速酶解策略利用電噴霧產生的皮升級微液滴將酶解反應加速到毫秒級，產物直接噴入質譜，裝置簡單，反應效率極高，但是僅適用于底物較為純凈單一的反應，目前尚難以推廣到樣品組成復雜、前處理操作繁瑣、需要經液相色譜分離的蛋白質組分析體系中?；诠潭ɑ阜磻鞯目焖倜附獠呗允俏Ⅲw系反應中最常用的快速酶解策略，樣品體積通常在百納升至百微升，酶解反應時間在2 s～2 h，它的作用效果穩定，能一定程度上減少酶自切反應的發生，可靈活放置于各類微反應器中，尤其適合流動反應體系。然而，固定化酶制備步驟相對繁瑣，對酶試劑的消耗較大，易向體系引入吸附殘留、交叉污染等問題。

促進蛋白質快速酶解的目的是加快蛋白組學樣品前處理的反應進程，以實現更大規模、更高通量的蛋白組學分析研究。在未來的研究中，如何對現有的蛋白質快速酶解策略進行選擇和組合，實現集成化、自動化的蛋白組學快速樣品前處理，是蛋白組學分析系統實用化進程中應該重點關注的問題。此外，隨著研究者們對細胞異質性的認識不斷加深，以及相關分析技術和儀器的不斷發展，針對少量細胞乃至單個細胞的蛋白組學研究已成為當前蛋白質組研究的熱點領域。目前文獻報道的快速酶解策略多以常規量的某一種或數種蛋白質作為底物，以蛋白質序列覆蓋度作為表征酶解效果的主要依據，這種方法的局限性是無法定量地反映體系中的所有蛋白質是否都被充分地酶解。當樣品中的蛋白質含量極低時，可能存在蛋白質酶解不充分、響應低于檢出限以至于影響蛋白質鑒定的問題。因此，對于少量和單細胞蛋白組學分析水平的微量樣品而言，在常規蛋白組學分析中所采用的加速酶解方案是否依然適用，仍需要進一步的試驗和驗證。