粘度刺激響應的熒光探針研究進展

王孔琛， 馮楊振， 陳杜剛

(武漢工程大學，化工與制藥學院，湖北武漢 430205)

1 引言

細胞微環境與細胞的新陳代謝，增殖分化等密不可分，是反映細胞生理活動是否正常進行的重要因素[1,2]。粘度作為細胞微環境的重要指標之一，影響著細胞內分子擴散、信號傳遞以及化學物質的運輸。粘度的異常變化常預示著細胞的功能發生障礙，從而誘發一系列疾病。同時，由于細胞內細胞器的作用不一，細胞內各區域的粘度也不盡相同。線粒體作為細胞內部的“動力車間”，除了給細胞供能以外，還參與諸如細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，并具有調控細胞生長和細胞周期的功能[3]。研究表明，粘度的異常變化可能導致線粒體功能失調，并導致一系列癥狀，例如動脈硬化、癌癥和心機能不全[4 - 6]。溶酶體是細胞內部的“消化車間”，其作為一種動態的細胞器，參與老化細胞器的清除、殺死病毒和病變以及細胞內信號的傳遞等等生理活動，對維持細胞內環境穩態有重大意義[7]。溶酶體粘度的異?？赡軐е录毎h境紊亂，從而影響生物正常生理活動，引起炎癥甚至癌癥等疾病。因此，精確監測細胞內不同部位的粘度變化，以揭示粘度與疾病的病理過程之間的微觀機理，對于疾病的探索極其重要。

傳統的粘度檢測工具包括落球粘度計、振動式粘度計、旋轉式粘度計和毛細管粘度計，但是這些工具只能用于宏觀粘度的檢測，而不適用于微觀環境。近年來，熒光成像因具有靈敏度高、侵入性小，時間分辨率好等優點而被研究者們廣泛關注，并大量用于細胞內活性分子的檢測、活體成像和成像引導的光療等領域。根據現有研究，開發對細胞內粘度有特異性響應能力的熒光探針，通過熒光成像的方式實時反映并跟蹤粘度的變化，是監測細胞內粘度變化的有效手段。本文將從熒光探針的設計結構和機理出發，主要介紹近5年來報道的部分靶向不同細胞器的粘度熒光探針，并探討結構-性能關系和生物成像應用。最后就該領域的現狀做出總結并對未來的發展提出展望，希望對開發性能更好的熒光探針用于細胞微環境粘度的探測提供參考。

2 粘度熒光探針簡介

2.1 粘度熒光探針的結構

常見的熒光團如香豆素類、萘酰亞胺類、羅丹明類、BODIPY類、花菁類、黃酮類和喹啉類等，它們具有諸多優異的光學性質，如光譜半峰寬較窄、摩爾消光系數大和熒光效率高，因而常被用來構建粘度刺激響應的熒光探針。這些染料分子大多是平面共軛性好的親脂性基團，由其所構建的熒光探針具有良好的脂溶性。為了提高探針的親水性，并賦予探針特定的細胞內靶向功能，通常在熒光染料上引入吡啶/三苯基膦陽離子或嗎啉基團等，可使探針分別定位到線粒體和溶酶體，并提高探針的生物相容性。

2.2 粘度熒光探針的識別機理

2.2.1 扭轉的分子內電荷轉移(TICT)從分子結構來講，大多粘度響應的熒光探針都是電子給體-共軛π橋-電子受體(D-π-A)型。當分子中的D和A非常強，且分子有一定的柔性時，在激發態下，分子內旋轉導致D和A處在正交的構象上，從而發生扭曲的分子內電荷轉移(TICT)作用，使得探針的熒光猝滅。而當細胞環境發生變化，如粘度升高時，分子內的運動會受到限制，從而抑制TICT，恢復探針的發光。由于粘度變化的幅度不同，熒光恢復的程度不一，據此實現對粘度的特異性識別。

2.2.2 聚集誘導發光(AIE)與傳統熒光染料不同，AIE分子在單分散態下不發光，而在聚集態下顯現出強熒光。這種獨特的發光模式使得該類型分子在聚集態下具有高的熒光亮度和優異的光穩定性，非常有利于其在生物環境的應用。在低粘性介質中，AIE分子內基團的自由運動耗散了激發態的能量，使得分子不發光；而當粘度升高時，分子內的運動受限，從而開啟熒光，因此可實現對粘度的檢測。

2.2.3 光致電子轉移(PET)該種類型的熒光探針一般由熒光染料和受體部分組成，在光激發下，熒光染料和受體之間會發生電子轉移作用，從而導致熒光發生猝滅。當熒光探針與目標分析物作用后，受體部分被破壞或者從分子中裂解，則可恢復熒光染料的熒光。當所選的熒光染料本身對粘度有靈敏的響應時，依據此機理可設計同時檢測粘度和其它分析物的多功能熒光探針。

3 粘度熒光探針的應用

3.1 檢測細胞質內粘度的熒光探針

香豆素類染料具有Stokes位移大、光穩定性好、生物相容性好等優點。2020年，本課題組將茚二酮與二乙胺香豆素基團共軛連接合成了近紅外熒光探針ACI[8]。在低粘度環境下，茚二酮與二乙胺香豆素之間單鍵的自由旋轉引起TICT現象，導致熒光猝滅(圖1)；而隨著環境粘度的增加，單鍵的旋轉受到抑制，從而使得分子的熒光增強。我們通過探針ACI檢測了經制霉菌素干預的HeLa細胞環境的粘度變化。實驗結果顯示，ACI的光穩定性和生物相容性好，同時具有長的激發波長和發射波長，在活體成像中應用時有望表現出高的信噪比。2017年，孟祥明課題組設計合成了以喹啉為骨架的雙光子熒光探針MCN(圖1)[9]。該探針在470 nm處熒光強度隨著粘度的增大而增強90倍，且不受pH、極性的影響。該課題組通過MCN監測了經依托泊苷誘導的HeLa細胞凋亡期間的粘度變化，并通過熒光壽命成像觀察了大鼠組織切片以及斑馬魚的粘度分布情況。

圖1 探針ACI和MCN的結構[8,9]Fig.1 Structure of probes of ACI and MCN[8,9]

3.2 檢測線粒體內粘度的熒光探針

線粒體基質中存在大量的酶和蛋白質。當環境粘度異常變化時，線粒體嵴將會發生堆積[10]，影響酶和蛋白質擴散的速率，最終導致神經退行性疾病、糖尿病和細胞惡性腫瘤等多種癥狀的發生[11 - 14]。因此，對線粒體內的粘度進行監測意義重大。

菁類染料一般具有長發射波長，且分子中有陽離子基團如吲哚鹽，能有效地定位在線粒體，常被選用來構建靶向線粒體的熒光探針。2019年，王慧課題設計合成了基于半花菁染料的水溶性熒光探針L(圖2)[15]，分子中引入二乙酸酯基團以提高生物相容性，并可以通過對該部分的細微調節使得發射光譜紅移。隨著溶液粘度的增加，L在590 nm處熒光強度增大23倍，同時熒光量子產率增大20倍。課題組通過L成功觀察了老鼠組織切片的粘度分布情況。2020年，葛健鋒課題組基于半花菁染料設計合成了三個定位線粒體的粘度探針1d-1f(圖2)[16]。相比于探針L，1d-1f的發射波長紅移至近紅外區間(652～690 nm)，在生物領域應用時具有光損傷小，背景干擾小的優點。

圖2 探針L、1d-1f、MitoSN和L1-L3的結構[15 - 18]Fig.2 Structure of probes of L,1d-1f,MitoSN and L1-L3[15 - 18]

除了吲哚陽離子之外，其它含陽離子的結構也能靶向線粒體。2018年，王慧課題組報道了以噻唑陽離子作為線粒體定位基團的粘度熒光探針MitoSN(圖2)[17]。該探針已成功應用于觀察活體斑馬魚幼蟲的微粘度。2019年該課題組又制備了一系列以喹啉陽離子為受體的熒光探針L1-L3(圖2)[18]。與MitoSN相比，L2、L3對粘度表現出了更高的敏感性，其中，L2在576 nm處熒光強度隨著粘度增強180倍，熒光量子產率增大280倍。L1-L3已經成功用于監測經藥物刺激后HeLa細胞中粘度的變化。

2019年，劉志洪課題組設計合成了近紅外熒光探針NI-VIS(圖3a)[19]。NI-VIS對粘度具有很高的靈敏度，隨著體系環境由水變為99%甘油，其熒光強度增大167倍。該探針已成功用于區分肝硬化組織與正常組織。2021年，唐波課題組基于吡啶陽離子構建了線粒體靶向熒光探針Mito-NV(圖3a)[20]。該課題組以Mito-NV為工具發現環境中存在過量的H2O2會使得粘度上升，而過量的陽離子如Pd2+，Cu2+會使得粘度下降。

圖3 (a)探針NI-VIS、Mito-NV、HOTPy和CS-Py-BC的結構[19-22]；(b)由左至右：HOTPy在對照組小鼠、經酒精干預后1天、2天、3天的小鼠體內生物成像[21]Fig.3 (a) Structure of probes of NI-VIS,Mito-NV,HOTPy and CS-Py-BC[19-22];(b) From left to right:In vivo imaging of mice in control group and mice with alcohol treatment in 1,2 and 3 days with HOTPy as the fluorescent probe[21]

上述的探針多數都是基于TICT機理構建的，但該類探針容易受到環境極性的影響，或是環境中存在的親電物質可能會破壞探針D-A結構導致探針功能失效。近些年來聚集誘導發射(AIE)由于其具有較大的Stokes位移，優異的光穩定性而逐步進入了研究人員的視野。2021年，本課題組基于熒光團四苯乙烯設計合成了AIE粘度探針HOTPy(圖3a)[21]。通過結構篩選發現，分子中引入助水溶性基團羥基，能有效提高HOTPy對粘度的選擇性。隨著環境粘度的增大，探針在611 nm處的熒光強度增大128倍。該探針已經成功用于急性酒精肝損傷小鼠模型的成像，以及經SILY治療后，該病癥變化的即時示蹤(圖3b)。

為了增加探針在線粒體內的滯留能力，2021年，董川課題組在分子內引入芐基氯亞基制備了探針CS-Py-BC(圖3a)[22]，使得當膜電位降低或消失時探針也不會失去對線粒體的靶向性，從而有效提高了檢測的準確度。經470 nm波長激發，CS-Py-BC在650 nm處的熒光強度隨粘度增大了92倍。

3.3 檢測溶酶體內粘度的熒光探針

溶酶體內含有豐富的水解酶，主要用于分解和代謝細胞內的蛋白和大分子。當外界物種進入溶酶體后，溶酶體內的水解酶會發揮作用將外來物種分解為細胞所需的物質。溶酶體內水解酶缺失或其功能發生異常變化時將會引起大量底物在溶酶體體內堆積，使得溶酶體內部粘度發生變化，最終導致各種疾病的發生，例如溶酶體貯積病、龐貝氏病、粘多糖疾病等。因此，對溶酶體粘度的變化進行檢測同樣具有重要的意義。

溶酶體是細胞微環境中酸度最高的細胞器，有與堿性物質結合的傾向，故常選用含有氨基的堿性嗎啉作為溶酶體的靶向基團。2018年，黃楚森課題設計合成了一個基于綠色熒光蛋白GFP的粘度探針Lys-V(圖4)[23]。該探針引入了對羥基苯甲醛以增大體系的共軛程度。研究發現該探針在515 nm處熒光強度與粘度之間存在良好的線性關系。并已經成功檢測了經地塞米松刺激后MCF-7細胞中溶酶體粘度變化。

圖4 探針Lys-V、Lys-CzFP和Lyso-NP的結構[23 - 25]Fig.4 Structure of probes of Lys-V,Lys-CzFP,and Lyso-NP[23 - 25]

2020年，錢鷹課題組報道了選用咔唑基團為單元合成的GFP粘度熒光探針Lys-CzFP(圖4)[24]。該探針具有較長的發射波長(560 nm)與較大的Stokes位移(78 nm)，同時具有優異的粘度響應能力。探針Lys-CzFP在560 nm處熒光強度隨著粘度增加了98倍，熒光量子產率從0.003增至0.253，熒光壽命由0.25 ns延長至1.12 ns。Lys-CzFP已成功用于檢測經地塞米松刺激后Bel-7402細胞內溶酶體粘度的變化。

上述探針雖然有著優異的光穩定性與較好的粘度響應，但是仍然存在著諸如激發和發射波長較短，穿透能力不夠，且易受到自熒光影響等問題。雙光子熒光成像因激發波長更長，能夠避免自熒光的干擾，同時具有更深的穿透效果，有望解決上述問題。2020年，孟祥明課題組以苯乙炔取代的萘胺基為TP熒光團合成了雙光子探針Lyso-NP(圖4)[25]。該探針在515 nm處的熒光強度與粘度之間有著良好的線性關系，且在860 nm處的雙光子吸收截面值隨著粘度的增加而增大。此外，探針的熒光壽命不隨pH而變化，可以通過熒光壽命成像來對環境的粘度進行檢測。

BODIPY類染料一般能系較低，很容易表現出長波長的信號。2018年，余孝其課題組基于BODIPY結構設計合成了雙光子熒光探針Lyso-B(圖5)[26]。該探針在環境pH<5時才會對粘度產生響應。在pH較高時，嗎啉基團因PET的機理猝滅了探針本身的熒光，而pH降低時，嗎啉基團被質子化，PET過程消失，探針的熒光開啟。經實驗發現，pH=2時，探針在甘油中的熒光強度比在水中高63倍，而比在pH=7.4的水高15 600倍。目前，Lyso-B已成功用于HeLa細胞中溶酶體的粘度檢測，Lyso-NP已經成功用于MCF-7細胞內溶酶體自噬過程的粘度檢測。

除了嗎啉基團之外，一些科研工作者還嘗試通過其它的基團來構造靶向溶酶體的熒光探針。2019年，郭煒課題組基于羅丹明染料設計合成了近紅外熒光探針BTP(圖5)[27]。隨著粘度的增加，苯并噻唑與吡羅紅之間的碳碳單鍵的旋轉被抑制，BTP在635 nm處的熒光強度增大83倍。此外，BTP能在較寬的pH范圍(pH=2～10)內對粘度響應，具有優異的穩定性。2020年，曾憲順課題組開發了半花菁近紅外熒光探針Lyso-cy(圖5)[28]。該探針通過苯基硒定位溶酶體，并具有更高、更快速的粘度響應，在710 nm處的熒光強度隨著粘度的增加而增大122倍。在不同pH中，Lyso-cy的結構存在酚式、旋酮式、酮式之間轉換，因此發射波長會隨著pH而變化。目前該探針已經成功監測經地塞米松刺激的HeLa細胞中溶酶體的粘度變化。

2020年，蔣健暉課題組設計合成了一個靶向溶酶體的探針Lyso-VR1(圖5)[29]。隨著環境粘度增加，Lyso-VR1在550 nm處熒光強度增大83倍。此外，該探針不受極性影響，能在pH=4～7.3的范圍內使用。值得一提的是，課題組通過Lyso-VR1與其同期研發的Mito-VR2首次實現了自噬過程中線粒體和溶酶體粘度變化的同時監測，發現此過程中兩者內部粘度都增加。

圖5 探針Lys-B、BTP、Lyso-cy和Lyso-VR1的結構[26 - 29]Fig.5 Structure of probes of Lys-B,BTP,Lyso-cy and Lyso-VR1[26 - 29]

4 多功能的熒光粘度探針

許多疾病導致的細胞微環境的變化不僅僅與粘度相關，還可能與許多化學物質水平的變化相聯系，能夠實現對這些化學物質含量的檢測對疾病的預防與臨床治療具有重大意義。因此除了上述能夠單獨靶向線粒體或者溶酶體的探針，科研工作者還設計合成了許多多功能型的水溶性粘度探針。

2020年，馮國強課題組基于喹啉設計合成了粘度與ONOO-雙重響應的近紅外熒光探針VO[30]。該探針的粘度響應基于TICT機理，并引入了苯硼酸作為ONOO-的識別基團(圖6a)。隨著環境粘度的增大，770 nm處的熒光強度增大36倍；當ONOO-加入后，探針顏色由藍色轉變為黃色，635 nm處熒光強度增大288倍，且在5 min內達到最大值。VO不受其它活性氧或活性氮等的干擾，能在pH=6～11的范圍內使用。同時，VO還可以檢測內源性與外源性的ONOO-，目前已經在斑馬魚和小鼠體內成功應用。課題組通過VO進行生物實驗發現過量的對乙酰氨基酚(APAP)會引起ONOO-含量增多，導致藥物誘導的肝毒性增加(圖6b)。

圖6 (a)探針VO和A-1的結構[30-31]；(b)探針VO在小鼠肝組織上的成像[30]Fig.6 (a)Structure of probes of VO and A-1[30-31];(b) Imaging of the mouse livers with VO[30]

2021年，Lee課題組設計合成了粘度與NO雙重檢測的探針A-1[31]。該探針中萘酰亞胺及其連接部分能夠對粘度產生響應，而(4-硝基苯)氨基硫脲部分則對NO產生響應(圖6a)。探針A-1在470 nm處與550 nm處的熒光強度分別隨著粘度的升高、NO含量的增加而增強。該探針對粘度的響應熒光為藍光，對NO的響應熒光為綠光，因此實現了對粘度與NO的同時檢測。探針A-1不受諸如Cu2+、Mg2+等陽離子，CN-、S2-等陰離子以及ONOO-、OH-等活性氧物質的影響，能在pH=5～9范圍內使用。此外，探針A-1可以檢測細胞內外源性/內源性的NO，且課題組通過將A-1應用于HeLa細胞中成功觀察到了制霉菌素刺激后粘度的升高、LPS刺激后NO水平的升高以及再經過NO合成酶抑制劑氨基胍干預后NO水平的下降。

除了活性氧之外，對于細胞微環境內含硫物質的含量監測也同樣十分重要。2020年，孔凡鵬課題組在已經合成的近紅外粘度探針DCMN的基礎上進一步對其羥基位點進行修飾，連接了H2S靶向基團2,4-二硝基苯磺酸酯，構建了一種H2S和粘度雙激活的熒光探針DCO-V-H2S(圖7)[32]。該探針中，2,4-二硝基苯磺酸酯通過PET作用猝滅探針本身的熒光；盡管在高粘度甘油中探針的熒光信號有一定的增強，但并不明顯。而當在甘油環境中加入H2S時，2,4-二硝基苯磺酸酯基團發生斷裂，探針的熒光則顯著增強，因此該探針只有在硫化氫和高粘度條件同時滿足時才能被激活，發出近紅外熒光。在cH2S=20 μmol/L時，探針630 nm處的熒光強度隨著PBS-甘油體系中甘油的比例增大而增強90倍；在高粘度的環境中，對H2S的響應限度高達40 μmol/L。此外，DCO-V-H2S還具有優異的穩定性，選擇性，良好的生物相容性，目前課題組已經通過DCO-V-H2S成功實現了對HeLa細胞經饑餓誘導與硫氫化鈉干預后粘度、H2S的雙重成像。

圖7 探針DCO-V-H2S、P-Py、Lyso-MC和B-1的結構[32-35]Fig.7 Structure of probes of DCO-V-H2S,P-Py,Lyso-MC and B-1[32-35]

2019年，張雷課題組基于半花菁染料MC-1設計合成了對粘度與β-淀粉樣蛋白都能響應的探針Lyso-MC(圖7)[34]，分子中引入了嗎啉基團使其具有溶酶體的靶向能力。Lyso-MC在615 nm處熒光強度隨著粘度的增大而增強33倍，且不受pH、極性等條件的影響；當Aβ1～42聚集體濃度上升至0.25 μmol/L時，探針在610 nm處熒光強度增強了10倍，且粘度的對數值、Aβ1～42聚集體濃度都與熒光強度線性相關。目前課題組已經成功將該探針用于PC12、SH-SY5Y細胞中粘度與Aβ聚集體濃度的監測。

2021年，李朝輝課題組設計合成了pH與粘度同時激活的探針B-1(圖7)[35]。該探針原結構中的亞氨基部分帶有一定的堿性，因此能夠靶向識別溶酶體。在酸性的環境下亞氨基被質子化成為氨基，此時其與吡咯紅之間的連接鍵可以自由旋轉，探針仍只表現出微弱的熒光，而在高粘度的環境中，分子內旋轉受限，才會發出強熒光。探針在554 nm處熒光強度隨著環境粘度增大增強50倍，且不受極性、活性氧、活性氮、ONOO-等諸多因素的影響，具有優異的選擇性。由于癌細胞內的pH比正常細胞低、粘度比正常細胞高，因此探針B-1能夠成為區分癌細胞與正常細胞的工具。目前已成功通過探針B-1觀察到了HepG-2荷瘤小鼠腫瘤細胞與正常部位細胞之間粘度與pH的差異。

5 總結與展望

熒光成像技術由于具有靈敏度高、毒性低、可視化等優點，被廣泛應用于生物成像研究。目前，大多數粘度熒光探針是基于TICT機理來設計構建，在對粘度檢測的過程中表現出了較高的靈敏度和優異的生物相容性。借助雙光子技術和近紅外熒光團，探針的吸收和發射信號都能紅移，達到生物光學透明區，不僅提高了組織穿透深度，還降低了背景干擾，對探針在活體中的應用大有好處。隨著AIE概念的提出，具有AIE特性的粘度探針能夠克服傳統的小分子熒光探針在水溶液中易聚集而導致熒光猝滅的缺點，具備更高的光穩定性和抗干擾能力，是熒光探針開發的新方向。

粘度熒光探針的發展已取得了巨大的進步，但仍存在一些問題有待研究解決，如：(1)探針信號的保真度問題。盡管很多探針因引入定位基團可以有效靶向到特定的細胞器，但是在特定區域的滯留能力還有待研究；較長時間的成像有利于跟蹤細胞內的粘度變化，從而解決相關疾病的問題，但是探針在細胞內的遷移擴散有可能導致假陽性或假陰性信號的干擾。(2)具體癥狀或疾病的深入研究。粘度作為一個重要的細胞內參數，其波動反映著細胞功能的變化，如果能找到以粘度作為有效標志物的特定病癥，將為粘度熒光探針開啟醫學診斷的大門。希望本文能為后續的研究工作者們提供新的思路，開發出更好的探針以滿足生物醫學領域的需要。