Fe2+-H2O2-RhB體系熒光猝滅法測定CAT活度

張愛菊， 白 瑩， 董 娜， 薛林科， 戴興德， 張小林*

(甘肅醫學院，甘肅平涼 744000)

過氧化氫酶(CAT)廣泛存在于生物組織細胞中，可適時分解糖代謝中間產物H2O2，在抗衰老、防病變等方面發揮重要生理作用[1,2]。自1811年CAT首次被發現以來，關于其活性測定方法的研究從未停止，相繼出現了滴定法[3]、光度法[4 - 8]。目前，研究的熱點主要集中于催化光度法[9]。

熒光光度法集穩定性、高靈敏性、低成本等于一體，羅丹明B(Rhodamine B，RhB)結構特殊，熒光產率高[10,11]，當其醌式結構遭到破壞，分子失去平面剛性結構而發生熒光猝滅。羅丹明B作為熒光探針在微量分析領域得到廣泛應用[12 - 14]，有文獻報道碘-羅丹明B締合物熒光探針用于測定魚肝提取液中CAT活度[15]。本文實驗發現，在Fe2+和H2O2的共同作用下，羅丹明B也存在熒光猝滅現象，CAT分解H2O2使羅丹明B熒光得以保留，根據CAT加入前后熒光強度差值ΔF可求得CAT活度。實驗對反應條件和抗干擾能力做了詳細考察，發現檢測體系具有更理想的穩定性和環境適應性，血清微量獲取并可直接用于酶活度檢測，方法有望早日應用于臨床檢驗。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

930N熒光光度計(上海精科)。

H2O2(30%，國藥集團化學試劑有限公司)：將30%H2O2稀釋500倍，化學分析法測其濃度，逐級稀釋1×10-3mol/L。CAT(≥3 000 U/mg,阿拉丁)標準溶液，稱取0.0050 g CAT，蒸餾水溶解，100 mL容量瓶定容，化學分析法測活度(E=100 U/mL)，二次稀釋至1 u/mL。羅丹明B(RhB)溶液：分析天平稱取0.0250 g RhB(分析純，福晨化學試劑有限公司)，蒸餾水溶解，500 mL容量瓶定容，根據準確濃度二次稀釋至1×10-4mol/L。0.1 mol/L pH 4.2的HAc-NaAc緩沖溶液。

1.2 測定方法

在50 mL的容量瓶中加入血清(25～100 μL)和H2O2(2.80 mL)，30 ℃水浴反應10 min，然后依次加入羅丹明B(5.00 mL)、HAc-NaAc(2.50 mL)和Fe2+(0.40 mL)，常溫靜置15 min后定容，蒸餾水作參比，在585 nm發射波長處測熒光強度F。同步測定酶空白體系F0(在血清中先加入羅丹明B、緩沖溶液和Fe2+，振蕩30 s使酶失活，再加H2O2室溫反應15 min)。CAT活度E(1 mL CAT溶液所消耗H2O2物質的量(μmol))由ΔF(ΔF=F-F0)確定。

2 結果討論

2.1 光譜分析

在585 nm處，羅丹明B有特征熒光峰(圖1a)；Fe2+作催化劑，H2O2氧化羅丹明B致其熒光猝滅，熒光強度F減小(圖1b)；CAT分解H2O2使得體系中H2O2濃度降低，從而一定程度上保持了羅丹明B的熒光(圖1c)，熒光保留程度與CAT活度有關系。本實驗確定羅丹明B熒光發射波長為585 nm。

2.2 熒光猝滅條件考察

2.2.1 催化劑考察本文選擇Fe2+和Fe3+作催化劑并對催化性能作比較。結果發現：羅丹明B和RhB+H2O2兩體系熒光光譜保持一致(圖2a)，說明在無催化劑情況下，H2O2不能氧化RhB；加入H2O2，同時加入Fe2+或Fe3+后，均出現熒光猝滅(圖2b、圖2c)，Fe2+作用下的羅丹明B猝滅程度更大(圖2b)；不加H2O2時，Fe2+和Fe3+分別與羅丹明B混合，Fe2+對羅丹明B無影響，而Fe3+亦可實現羅丹明B熒光等效猝滅(圖2d)。由此說明，Fe3+不是催化劑而是氧化劑；本實驗選擇Fe2+作熒光猝滅反應的催化劑。

圖1 不同溶液的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different solutions

圖2 催化作用比較Fig.2 Comparison of catalysis

2.2.2 羅丹明B用量酶活性的測定范圍與羅丹明B的用量有著密切的關系，若羅丹明B的用量偏小，酶活性的測定范圍變窄；若用量偏大，分子之間的締合作用導致體系的穩定性變差，測定準確度降低。pH 4.2 HAc-NaAc緩沖介質中，考察羅丹明B熒光強度隨溶液體積的變化情況。結果顯示，體系的熒光強度F值隨著溶液體積的增大而逐漸增大，當羅丹明B在0.00～5.00 mL范圍內時，熒光強度與體積有線性關系，因此羅丹明B的最佳用量確定為5.00 mL，此時羅丹明B反應液濃度為1.0×10-5mol/L。

2.2.3 溶液pH考察RhB熒光猝滅實為氧化反應，酸性環境更有利于H2O2得電子，也將最大限度減少Fe2+沉淀損失。對于熒光猝滅反應體系H2O2+RhB+Fe2+，其它條件不變，在pH 1.0～5.5范圍內進行溶液pH考察，結果表明，熒光強度在pH 4.2出現一最低值，故選擇HAc-NaAc緩沖溶液作猝滅反應介質，最佳用量確定為2.50 mL。

2.2.4 熒光猝滅反應時間考察其它條件不變，考察氧化反應時間對H2O2+RhB+Fe2+體系熒光強度的影響。結果表明，在催化劑Fe2+的作用下，羅丹明B快速被氧化，熒光強度在5 min內迅速下降，5 min后反應變緩，15 min后降到最低且保持恒定。因此猝滅反應時間確定為15 min。

2.2.5 Fe2+用量的選擇其它條件不變，在0.00～0.20 mL范圍內，測定加入不同體積Fe2+時的H2O2+RhB+Fe2+體系熒光強度。結果可知，當V(Fe2+)=0.00 mL時，羅丹明B與H2O2幾乎不反應；熒光強度F隨Fe2+體積增大而減??；當V(Fe2+)>0.60 mL時，熒光猝滅反應程度受限，應該是過量Fe2+促使H2O2分解。因此，Fe2+用量設定為0.40 mL。

2.3 酶促反應條件優化

2.3.1 底物H2O2體積優化針對酶空白體系，在最佳猝滅反應條件下，改變H2O2體積用量，測定熒光強度。結果顯示熒光強度隨H2O2體積增加而減小，在0.00～2.80 mL范圍內有明顯的猝滅現象，且熒光強度和H2O2體積有良好的線性關系，當H2O2體積大于2.80 mL時，線性關系變差。為了增大酶活性測定范圍，減小系統誤差，取1×10-3mol/L H2O2溶液2.80 mL作酶反應底物。

2.3.2 酶促反應時間影響取CAT標準溶液1.00 mL，僅改變酶促反應時間，測定ΔF。結果表明，酶促反應速度較快，前5min，ΔF與時間有線性關系，這符合一級反應特征；10 min后，ΔF保持一個最大值恒定不變。故將酶促反應時間定為10 min。

2.4 方法對CAT的分析性能

針對CAT+H2O2+RhB+Fe2+體系，在0.00～3.50 mL體積范圍內改變CAT標準溶液用量，在最佳條件下測定F、F0并計算ΔF，繪制工作曲線。結果顯示：CAT的加入促使羅丹明B熒光恢復(圖3)，熒光強度增幅ΔF與CAT活度E在5.6×10-5～5.6×10-2U/mL范圍內具有良好的線性關系(圖3內插圖)：ΔF=-3.466+1 472E(U/mL)，r=0.9962，平行測定酶空白10次，標準偏差的3倍除以斜率求得檢測限為2.6×10-5U/mL。

圖3 測定CAT的熒光光譜及活度工作曲線Fig.3 Fluorescence spectra of CAT and plot for CAT activity

2.5 血清共存物質的影響

2.6 反應機理的探討

不存在Fe2+時，H2O2幾乎不與RhB反應，在30 ℃恒溫60 min后體系的熒光強度基本保持不變。在H2O2和RhB溶液中加入少量Fe2+后，反應迅速，結合相關研究[16]，反應機理推測如下:

Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·

Fe3++H2O2+OH-=Fe2++H2O+HO·

Fe3++H2O2=Fe2++H++·HO2

·HO2+H2O2=H2O+O2↑+HO·

活性物質HO·攻擊RhB的發色基團并使其降解，直至轉化成CO2和H2O，發生熒光猝滅。

2.7 血清酶活度分析

對6份血清(由甘肅醫學院附屬醫院體檢中心提供，屬于正常個體)樣本CAT活度按“1.2測定方法”進行測定，并和碘量法作對比，結果見表1。血清CAT活度測定值在28～31 U/mL范圍內，結果與碘量法基本保持一致；加標回收率和標準偏差計算進一步證明該方法具有良好的準確度和較高的精密度。

表1 樣品分析及回收率實驗結果(n=6)