微小RNA-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素在慢性心力衰竭患者中的表達及聯合檢測的意義△

李 嘉，鄭志君，王曉蕊，趙小丹，苗昌榮

（唐山市協和醫院心內科，河北唐山 063000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是在原有慢性心臟疾病上發展至心力衰竭癥狀和體征的一組復雜臨床綜合征，主要臨床表現為液體潴留和活動耐量受限，常因各種誘因急性加重需住院治療，因此，早期診斷極為重要［1］。目前臨床對心力衰竭的診斷幾近完善，普遍使用氨基末端腦鈉肽前體診斷和評估預后［2］，但其易受諸多非心源性疾病影響，且僅能反映心力衰竭一個方面，還需探索更多的生物標志物。研究表明，心肌缺氧、炎癥反應、心肌纖維化在CHF 發生和發展中發揮重要作用［3-5］。Chouvarine 等［6］通過實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）陣列分析發現，微小RNA（microRNA，miR）-197 在心肌缺氧誘導的心力衰竭小鼠模型中表達上調。半乳糖凝聚素-3為一種炎癥信號分子，可通過誘導單核細胞遷移促進血管炎癥反應［7］。骨膜素是心臟間充質組織發育中重要細胞外基質蛋白，研究報道其與壓力超負荷引起的心肌纖維化相關［8］。本研究旨在分析CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度變化，探討三者聯合預測CHF 的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取唐山市協和醫院2019 年1 月至2020 年12月收治的128例CHF患者為CHF組，其中男80例，女48例；年齡為（60.24±5.68）歲；體質量指數（22.44±2.12）kg/m2；紐約心臟協會（New York Heart Associ?ation，NYHA）［9］心功能分級：27 例Ⅰ級、43 例Ⅱ級、36 例Ⅲ級、22 例Ⅳ級。納入標準：（1）符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［9］CHF 診斷標準；（2）年齡≥18 歲；（3）臨床資料完整；（4）患者及家屬均知情研究。排除標準：（1）血液、免疫、造血系統疾患者；（2）惡性腫瘤患者；（3）嚴重肝、腎功能障礙患者；（5）近3 個月內口服抗凝藥物患者；（6）肺源性心臟病、心臟瓣膜病、急性心肌梗死患者。另選取同期60 名體檢健康者為對照組，其中男37 名，女23 名；年齡為（59.85±5.72）歲；體質量指數為（21.72±2.28）kg/m2。兩組受試者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經倫理委員會批準（批號：201803245）。

1.2 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度測定方法

采集CHF組患者入院時和對照組受試者體檢時靜脈血6 mL，3 000 r/min 離心10 min（半徑10 cm），取上清，其中3 mL 加入Trizol（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：R1030）提取血清RNA，TaKaRa逆轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，貨號：RR036A）轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR 反應。miR-197 正向引物5'-ATTACTTTGCCCATATTCAT?TTTGA-3'，反向引物5'-ATTCTAGAGGCCGAGGC?GGCCGACATGT-3'。反應體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.2 μL 正向引物，0.2 μL 反向引物，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6.0 μL ddH2O；擴增條件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，72℃30 s，循環40 次。以U6 做內參校正，正向引物5'-CTCGCTT?CGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCAC?GAATTTGCGT-3'，2-ΔΔCt法計算血清miR-197 相對表達量。另3 mL 酶聯免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測定半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度，試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供，貨號：E00033、E07024。

1.3 超聲心動圖檢查

CHF 患者入院后采用飛利浦Epiq 7C 彩色超聲診斷儀（X5-1 探頭頻率：1～5 MHz）進行超聲心動圖檢查，測定左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD），雙平面Simpson 法測量左心室射血分數（left ventricu?lar ejection fraction，LVEF）。

1.4 觀察指標

（1）比較兩組受試者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度和心功能指標；（2）比較不同心功能分級CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度；（3）分析CHF患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度與心功能指標的相關性；（4）分析血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度對CHF 的預測價值。

1.5 統計學分析

選用SPSS 26.0統計學軟件。計數資料以［n（%）］表示，采用卡方（χ2）檢驗。正態分布計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；偏態分布計量資料以M（QL～QU）表示，兩組間比較采用Z檢驗。相關性采用Pearson/Spearman 相關性分析。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度對CHF 的預測價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）采用Z檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較

CHF 組患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組受試者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較 ［M（QL～QU），±s］

表1 兩組受試者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較 ［M（QL～QU），±s］

2.2 兩組受試者心功能指標比較

CHF 組患者LVEDD、LVESD 明顯高于對照組，LVEF 明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者心功能指標比較［M（QL～QU），±s］

表2 兩組受試者心功能指標比較［M（QL～QU），±s］

2.3 不同心功能分級CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較

NYHA 心功能Ⅲ～Ⅳ級患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度明顯高于Ⅰ～Ⅱ級患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同心功能分級CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較 ［M（QL～QU），±s］

表3 不同心功能分級CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度比較 ［M（QL～QU），±s］

2.4 CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度與心功能指標的相關性

Pearson/Spearman 相關性分析結果顯示，CHF患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度與LVEDD、LVESD 呈正相關，與LVEF 呈負相關（P＜0.05），見表4。

表4 CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度與心功能指標的相關性分析結果

2.5 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度對CHF 的預測價值

ROC 分析結果顯示，三項聯合預測CHF 的AUC 明顯大于miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素單獨預測（Z=3.720、3.977、2.965，P=0.000、0.000、0.003），見表5、圖1。

表5 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度對CHF 的預測價值

圖1 血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度預測CHF 的ROC 圖

3 討論

心力衰竭是各種心血管疾病的必然終點，隨著人均壽命的延長，心力衰竭患病率逐年上升，2012～2015 年我國心力衰竭患病人數較過去15 年增加了900 多萬人［10］，住院病死率高達4.1%［11］，疾病形勢嚴峻。目前尚不完全明確其發病機制，現有研究證實其涉及氧化應激、炎癥反應、心臟基質重構、心肌損傷、心肌牽拉、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、神經內分泌激素激活、腎功能不全等多個方面［2］。盡管近年來醫學技術的發展豐富了臨床治療手段，但現有措施仍以改善或控制CHF 臨床癥狀為主，并不能從根本上逆轉其病理改變，因此，還需探索更多生物標志物，為研究CHF 機制提供基礎。

MiR 能通過與靶基因mRNA 的3'非翻譯區的堿基互補結合，使靶基因mRNA 翻譯抑制和降解，近年研究表明，多種miR與CHF發生、發展相關［12］。MiR-197 廣泛表達于心、肝、肺、胃腸道等組織，與多種腫瘤發生密切相關［13-14］。近年研究發現，miR-197 還與心肌損害有關，如miR-197 為心肌梗死差異表達miR，血液循環中miR-197 是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊咝难芩劳霆毩L險因子（HR=1.77）［15-16］。本研究結果顯示，CHF 組血清miR-197 濃度明顯升高，說明miR-197可能參與CHF 發生。進一步分析顯示，心功能Ⅲ～Ⅳ級患者血清miR-197 濃度明顯提升，并與LVEDD、LVESD、LVEF 存在顯著相關性，說明miR-197還與CHF患者心功能改變有關，參與CHF發展，其機制可能與miR-197 通過誘導心肌細胞凋亡參與CHF 發生、發展有關。Zampetaki 等［15］和Schulte等［16］研究表明miR-197 與心肌損害密切相關。髓系白血病-1 能結合B 淋巴細胞瘤-2 基因家族促凋亡成員，發揮抗心肌細胞凋亡作用［17］。劉祖霞等［18］通過高糖誘導建立糖尿病心肌病模型發現，miR-197 能靶向負調控髓系白血病-1 促進心肌細胞活力降低和凋亡。

炎癥反應為心力衰竭重要病理生理機制之一，可能早于典型神經激素激活，通過誘導心肌細胞凋亡、心肌纖維化、促進心室重構等多種途徑參與心力衰竭發生、發展［2］。半乳糖凝聚素-3 為β-半糖苷動物凝集素家族成員，主要由巨噬細胞活化產生，通過非經典途徑分泌到細胞表面及細胞外空間，能促進炎癥細胞活化和放大炎癥反應［19］。已有研究報道其參與動脈粥樣硬化、膿毒癥等炎癥疾病進展［20-21］。本研究結果顯示，CHF組患者血清半乳糖凝聚素-3 濃度明顯升高，說明半乳糖凝聚素-3 可能參與CHF 發生。進一步分析顯示，心功能Ⅲ～Ⅳ級患者血清半乳糖凝聚素-3濃度明顯提升，并與LVEDD、LVESD、LVEF 存在顯著相關性，說明半乳糖凝聚素-3 還與CHF 患者心功能改變有關，參與CHF 發展。分析是因為半乳糖凝聚素-3 作為一種炎性介質，其高表達會加重心臟組織炎癥反應，促進CHF 發生?；A實驗顯示，心包內注射半乳糖凝聚素-3 會加重心力衰竭小鼠心臟組織炎癥損傷，并通過多條信號通路導致心肌纖維化和心室重構［22-23］。

心臟成纖維細胞為調節細胞外基質合成與降解的主要細胞，心肌受損時會移至受損區域形成膠原纖維等修復心肌，若成纖維細胞過度增殖、細胞外基質膠原分泌增加、膠原比例失調則會改變心臟組織膠原成分，導致心肌纖維化［24］。骨膜素是新近發現的一種分泌型可溶解性細胞間基質蛋白，主要由細胞間成纖維細胞產生，能促進成纖維細胞增殖和細胞外基質蛋白的合成能力，影響膠原纖維的成熟度與融合［25］。近年研究報道，肺組織和氣道組織纖維化狀態下，骨膜素表達顯著上調［26］。本研究結果顯示，CHF 組血清骨膜素濃度明顯高于對照組，說明骨膜素可能參與CHF 發生。進一步分析顯示，心功能分級Ⅲ～Ⅳ級患者血清骨膜素濃度明顯提升，并與LVEDD、LVESD、LVEF存在顯著相關性，說明骨膜素還與CHF 患者心功能改變有關，參與CHF 發展。推測與骨膜素大量表達導致心臟成纖維細胞過度增殖和細胞外基質蛋白合成引起心肌纖維化有關。Kaur 等［27］建立心肌梗死小鼠模型發現，敲除骨膜素蛋白表達能減少小鼠心肌纖維化，改善心功能，佐證了本研究結果。其機制可能與骨膜素通過轉化生長因子-β/骨形態發生蛋白信號通路促進組織纖維化有關［28］。本研究ROC 分析結果顯示，血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度均可作為CHF 預測指標，且三項聯合預測的AUC 顯著增加，說明聯合檢測血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度能提升CHF 預測價值。

綜上所述，CHF 患者血清miR-197、半乳糖凝聚素-3、骨膜素濃度明顯提升，與心功能密切相關，聯合檢測能提升CHF 預測價值。