基于網絡藥理學及分子對接探討補中益氣丸治療白細胞減少癥的作用機制

何浩麟，張延峰，陶 琴，雷 歡，李 雷，方海紅

（江西科技師范大學藥學院，江西 南昌 330013）

1 前言

白細胞減少癥（leukopenia）是腫瘤放、化療過程中出現的常見不良反應，主要特征為外周血白細胞計數持續低于4.0 × 109/L[1]。白細胞減少會導致機體免疫功能下降，易誘發感染，嚴重的白細胞減少癥會導致敗血癥、膿毒血癥的出現，甚至危及生命[2]。中醫學無白細胞減少癥之病名，據其證可歸屬于中醫學“虛損”、“虛勞”等范疇，病機為脾腎兩虛、氣血不足，臨床常以健脾益腎、補益氣血等方藥加以治療[3，4]。

補中益氣丸為中醫經典名方，由黃芪、黨參、白術、甘草、柴胡、升麻、當歸和陳皮等多味中藥配伍而成的丸劑。方劑君藥為黃芪，具有補元氣、氣行的作用[5]；臣藥黨參、白術和甘草具有補中益氣、健胃補脾的功效；當歸活血而補血，化瘀而不傷正；陳皮理氣和胃、補而不滯，升麻和柴胡聯用升陽舉陷為佐藥，多藥聯用共奏補中益氣、升陽舉陷之功，臨床常用于脾胃虛弱、中氣下陷所致的體倦乏力、腹瀉、脫肛等癥[6，7]。臨床研究表明補中益氣湯可有效改善治療化療致白細胞減少癥[8]，并有補中益氣丸與六味地黃丸聯合治療白細胞減少癥的相關文獻報導[9]，但其治療白細胞減少癥的作用機制尚不明確。

網絡藥理學融合了生物信息學、系統生物學和網絡科學，從生物網絡和系統層次的整體角度解析藥物與治療疾病間的分子關聯，揭示藥物的系統性作用及機制，指導新藥的研究與開發[10]。網絡藥理學的研究策略與中醫藥對疾病整體的認識相符合。構建“中藥-多成分-多靶點-疾病”網絡，有利于篩選中藥活性成分及闡明中藥的作用機制[11，12]。網絡藥理學廣泛應用于中藥及其復方的作用機制研究和探索，為復方配伍機制和探究思路提供幫助[13，14]。因此，本文采用網絡藥理學及分子對接技術分析了補中益氣丸治療白細胞減少癥的作用機制，為其治療白細胞減少癥的臨床應用提供科學依據。

2 實驗方法

2.1 補中益氣丸主要活性成分與作用靶點的篩選

通過中藥系統藥理數據庫（TCMSP，www.tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索黃芪、白術、甘草、黨參、陳皮、當歸、柴胡以及升麻，并加以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選標準挖掘補中益氣丸中符合條件的活性成分以及對應靶點。通過中醫藥百科全書數據庫（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）檢索，以QED 大于0.67 及評分為Good 和Moderate為篩選標準挖掘補中益氣丸中符合條件的主要活性成分以及對應靶點[15，16]。最終，將收集到的靶點合并去重整理獲得補中益氣丸的作用靶點。

2.2 補中益氣丸的藥物-活性成分-靶點網絡的構建

將上述數據庫收集所得到的藥物主要活性成分及其對應靶點導入到Cytoscape3.9.1 中，構建復方藥物-活性成分-靶點三者的網絡關系，最后整合繪制得到藥物-活性成分-靶點網絡圖。

2.3 白細胞減少癥疾病靶點的獲取

以“leukopenia”作為關鍵詞，分別在人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNet（http://www.disgenet.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫檢索，篩選并收集有關白細胞減少病癥的相關靶點基因。另外，根據前期轉錄組測序結果進行分析，得到環磷酰胺致白細胞減少癥小鼠的差異基因，將數據庫檢索及測序獲得的基因整合獲得白細胞減少癥的疾病靶點。

2.4 PPI 網絡的構建與核心靶標篩選

將整理且合并后的補中益氣丸所對應靶點基因，以及白細胞減少疾病相關的靶基因導入到Venny2.1.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中，獲得中藥復方-疾病的交集靶點韋恩圖；在STRING（http://cn.string-db.org/）數據庫對得到的交集靶點進行映射，構建新的靶點網絡圖[12]?；钚猿煞旨白饔冒悬c用“節”和“點”表達，節點間的相互作用關系用“邊”表達。通過Cytoscape3.9.1 對補中益氣丸-白細胞減少癥交集靶點網絡圖進行分析，以“degree”、“Closeness Centrality”及“Betweenness Centrality”作為篩選的指標[17，18]，找到排名較靠前的基因，并與韋恩圖所找到交集靶點基因進行匯總，可以得到補中益氣丸治療白細胞減少癥的核心靶標基因。

2.5 核心靶標的GO 與KEGG 富集分析

運用注釋及集成發現數據庫（DAVID,https://david.Ncifcrf.gov/）對上述篩選的核心靶標基因進行分析。物種設定為“Homo sapiens”，基因修正為“official gene symbol”，進行基因本體（GO）生物功能與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析[19]。最終得到補中益氣丸干預白細胞減少癥的KEGG 信號通路和GO 富集分析數據。

2.6 分子對接驗證

從補中益氣丸中選出對應靶點較多化合物與關鍵核心靶點進行分子對接驗證。經PubChem 得到補中益氣丸關鍵活性成分的2D 結構，再經Chem3D進行能量最小化得到其mol2 格式。從PDB 數據庫得到核心靶點代號，經PYMOL 去除核心靶蛋白的水分子及配體。使用Auto Dock Tools1.5.6 對靶蛋白加氫加電荷后將蛋白質和化合物轉為受體和配體，并將其轉換成pdbqt 格式后可進行分子對接操作。當結合能小于-5 kcal/mol 則說明兩者具有良好結合性。最后通過PYMOL 將對接的化合物與靶標蛋白進行分子對接可視化分析。

3 結果與討論

3.1 補中益氣丸活性成分與靶點的篩選

本文通過TCMSP 與ETCM 數據庫的查詢與篩選得到黃芪18 個成分、白術10 個成分、甘草111 個成分、黨參30 個成分、陳皮17 個成分、當歸25 個成分、柴胡28 個成分及升麻12 個成分。通過刪除重復項與匯總后得到補中益氣丸成分共221 個，其中部分活性成分基本信息見表1。

表1 補中益氣丸部分活性成分的基本信息

3.2 補中益氣丸藥物-活性成分-靶點網絡的構建

通過Cytoscape3.9.1 構建上述獲得的藥物成分的藥物-活性成分-靶點網絡圖。網絡圖中包含了8個藥物節點，221 個活性化合物，632 個靶標節點和5127 條邊。通過Cytoscape3.9.1 軟件中的Analyze Networks 分析功能得到度值排名前三的化合物分別是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和壬酸（Nonanoic Acid）。

3.3 白細胞減少癥靶點基因的獲取

通過OMIM、DisGeNet 以及Drugbank 數據庫篩選并且收集有關白細胞減少疾病的靶點基因共1868 個；轉錄組測序獲得白細胞減少癥小鼠與正常小鼠差異基因664 個，整合后得到白細胞減少癥靶點基因共2465 個。

3.4 核心靶標的篩選及PPI 網絡構建

通過Venny2.1.0 在線作圖工具，得到補中益氣丸藥物-白細胞減少癥疾病的交集靶點共94 個（圖1），應用STRING 數據庫對核心靶點進行PPI 網絡分析，使用Cytoscape3.9.1 進行可視化處理，得到重要核心靶標網絡（圖2）。根據“degree”數值大小進行篩選，最終，篩選出的前十位的核心靶點，分別為AKT1、MMP9、IL1β、STAT3、PTGS2、MYC、CCL2、IL10、CREB1、FOS 等靶標基因。

圖1 補中益氣丸、白細胞減少癥與轉錄組測序獲得的白細胞減少癥致小鼠差異基因交集靶點韋恩圖A：補中益氣丸對應靶標基因 B：疾病對應靶標基因

圖2 核心靶點基因網絡圖

3.5 GO 功能注釋與KEGG 通路富集分析

本文將收集得到的94 個潛在靶標導入DAVID數據庫進行GO 功能注釋以及KEGG 通路富集分析。根據P 值大小將GO 功能注釋的生物過程（bological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的各前10 條整理為功能富集條形圖（圖3）。結果顯示，生物過程（BP）主要涉及細胞對碳水化合物刺激的反應、神經膠質細胞增殖的調控、正向調控漿細胞的分化及細胞對白細胞介素-17 的反應等過程；細胞組成（CC）包括核膜腔、電壓門控鈉通道復合物、特定顆粒管腔、基質膜以及三級顆粒管腔等；分子功能（MF）主要涉及花生四烯酸12-脂氧合酶活性、G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、CCR5 趨化因子受體結合及磷脂酶抑制劑活性等功能。補中益氣丸可能通過上述功能來減緩白細胞減少癥并起到部分升高白細胞的效果；將潛在靶點進行KEGG 通路富集共獲得344 條通路（P＜0.05），顯示補中益氣丸治療白細胞減少癥主要涉及PI3K-Akt 以及多種白介素的信號通路、免疫細胞相關信號通路，如IL-4、IL-13、IL-17、IL-18信號通路以及Th17、TNF 信號通路和JAK-STAT 信號通路（圖4）。

圖3 GO 生物功能富集分析圖

圖4 KEGG 通路富集分析圖

3.6 分子對接的驗證

將核心靶點與補中益氣丸的主要活性成分進行分子對接。通常認為結合能小于－5 kcal/mol 時結合性能良好，且結合能越低結合性能越好。從對接結果得知，活性成分槲皮素（Quercetin）和山奈酚（Kaempferol）與Akt1 結合度良好，結合能分別為－6.61 kcal/mol、－7.17 kcal/mol?；钚猿煞稚侥畏樱↘aempferol）與IL-1β 結合度良好，結合能為－5.23 kcal/mol。運用Pymol 對結果進行可視化分析（圖5）。

圖5 分子對接驗證圖

由上述KEGG 通路富集分析表明補中益氣丸的主要活性成分的潛在靶標與PI3K-Akt、炎癥以及免疫等相關信號途徑相關。分子對接驗證也表明補中益氣丸中關鍵活性成分槲皮素和山奈酚與Akt1、IL-1β 等核心靶點結合度良好。已知蛋白激酶（Akt）是一種原癌基因，為PI3K/AKT/mTOR 等多種信號通路中的關鍵基因，在調控細胞功能包括增殖、轉錄和代謝時發揮著重要作用[20]。研究表明PI3K/Akt/mTOR 對維持造血干細胞的自我更新具有重要作用，PI3K/Akt 的過度激活使骨髓造血干細胞脫離靜止狀態進入細胞周期增殖，并離開造血微環境[21]。研究發現環磷酰胺干預后，Akt1、PI3K 及pAkt 蛋白表達水平顯著降低，小鼠的造血功能顯著下降，白細胞數目減少，黃芪皂苷可激活PI3K 水平恢復小鼠骨髓抑制，增強免疫功能[22]。白細胞介素-1β（IL-1β）是白細胞介素家族的一類細胞因子，參與體內炎癥、免疫及組織修復。有研究表明，當體內IL-1β 水平異常時，代表體內的免疫功能出現異常[23]。有學者發現，脊髓損傷會產生大量的炎癥因子，包括IL-1α、IL-1β 及TNF[24]。環磷酰胺引發小鼠脊髓損傷出現白細胞減少癥，小鼠體內會產生大量的炎癥因子例如IL-1β 來維持體內穩定免疫功能[25]。

4 結論

本文通過網絡藥理學和前期測序結果初步探究了補中益氣丸改善白細胞減少癥的作用和機制，并利用分子對接方法對補中益氣丸的主要成分和關鍵靶點進行了驗證。顯示補中益氣丸的活性成分及關鍵靶點研究較為充分，也表明補中益氣丸通過多成分、多靶點發揮協同治療白細胞減少癥的作用。但本研究僅對補中益氣丸治療白細胞減少癥進行了初步的預測和分析，尚待進一步對補中益氣丸的治療白細胞減少癥的機制進行科學實驗驗證。