馬鈴薯多酚氧化酶的分離純化及酶學特性研究

洪麗萍 汪文華 何恩銘 張文惠

洪麗萍，汪文華 ，何恩銘，等.馬鈴薯多酚氧化酶的分離純化及酶學特性研究［J］.福建農業科技，2023，54（12）：54-61.

收稿日期：2023-11-02

作者簡介：洪麗萍，女，1969年生，助理研究員，主要從事植物生理及農產品保鮮研究。

*通信作者：汪文華，男，1985年生，副研究員，主要從事植物逆境生理研究（E-mail：wangwenhua0629@163.com）。

基金項目：廈門市重大科技計劃項目（3502Z20211004）；廈門市科技扶貧項目（3502Z20194509、3502Z20204504-2、3502Z20204501-3）。

摘? 要：為控制馬鈴薯在貯藏和加工過程發生的酶促褐變，對馬鈴薯多酚氧化酶進行分離純化，并研究其酶學特性。采用緩沖液提取、低溫離心得到馬鈴薯多酚氧化酶（PPO）粗酶液，粗酶液經硫酸銨分級鹽析、Sephadex G-25分子凝膠柱層析脫鹽處理、DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱層析和Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析分離純化得到馬鈴薯PPO，進一步對其部分酶學特性進行研究。結果顯示：純化后的馬鈴薯PPO其比活力為 283.0 U·mg-1，回收率為16.8% ，純化倍數為18.6倍；該酶最適反應溫度為30℃，最適反應pH為6.5；以鄰苯二酚為底物時，最適底物濃度為50 mmol·L-1。該酶對焦性沒食子酸、間苯二酚的底物親和性較強，對4-甲基兒茶酚、咖啡酸、沒食子酸、對苯二酚、鄰苯二酚、綠原酸的底物親和性較低，對N-BOC-酪胺、愈創木酚親和性很低。

關鍵詞：馬鈴薯；多酚氧化酶；純化；酶學特性

中圖分類號：S 532??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）12-0054-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.008

Study on the Separation and Purification of Polyphenol Oxidase from Potatoand Its Enzymatic Properties

HONG Li-ping， WANG Wen-hua*， HE En-ming， ZHANG Wen-hui

（Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Fujian Institute ofSubtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China）

Abstract： In order to control the enzymatic browning of potato during the storage and processing， the potato polyphenol oxidase was isolated and purified， and its enzymatic properties were studied. The crude enzyme fluid of potato polyphenol oxidase （PPO） was obtained by the extraction of buffer solution and centrifugation at low temperature. Then， the crude enzyme fluid was separated and purified through the ammonium sulfate salt fractionation， Sephadex G-25 molecular gel column chromatography desalination treatment， DEAE Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatography and Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration chromatography to obtain the potato polyphenol oxidase， and some of its enzymatic properties were further studied. The results showed that： the specific activity of purified PPO was 283.0 U·mg-1， the recovery rate was 16.8%， and the purification fold was 18.6 times. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 30℃ and 6.5， respectively. When catechol was used as the substrate， the optimal concentration of substrate was 50 mmol·L-1. The enzyme had strong substrate affinity for pyrogallic acid and resorcinol， and had low substrate affinity for 4-methylcatechol， caffeic acid， gallic acid， hydroquinone， catechol and chlorogenic acid， while having low affinity for N-BOC-tyramine and guaiacol.

Key words： Potato； Polyphenol oxidase； Purification； Enzymatic properties

馬鈴薯Solanum tuberosum L.是除小麥、大米和玉米之外，世界上消費量最大的食物之一，含有豐富的碳水化合物、膳食纖維、類胡蘿卜素、花青素和微量營養素（如維生素C、維生素B6、鉀、葉酸、鐵、硫胺、核黃素和煙酸），生產周期相對較短且產量很高，可以用各種方式烹飪用于不同的菜肴，如土豆泥、土豆面包、薯條、土豆片和土豆沙拉等，深受消費者喜愛。馬鈴薯在收獲、貯藏和運輸過程中常常因機械損傷而發生酶促褐變，在新鮮加工過程和加工后也容易發生酶促褐變，造成營養、感官、味道等多種重要品質發生下降，對馬鈴薯的生產產生不利影響。

酶促褐變是果蔬貯藏和加工過程中的常見現象，主要是由多酚氧化酶引起的。多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）是自然界中普遍存在的一類含銅酶，能利用氧分子催化單酚的羥化反應生成二酚，并進一步氧化生成具有顏色和高度活性的醌，醌類物質經自身縮合或與內源性氨基酸和蛋白質發生反應，形成黑色或褐色物質，促使果蔬發生酶促褐變，影響果蔬及其加工產品的營養風味及加工性能［1-4］。因此，研究馬鈴薯多酚氧化酶的酶學特性對馬鈴薯貯藏保鮮及產品加工過程中防褐變技術的開發應用具有重要意義。

目前，國內外對果蔬中多酚氧化酶分離純化及特性研究已十分廣泛，包括山藥［5］、絲瓜［6］、硬粒小麥［7］、芒果［8］、人參果［9］和茶葉［10］等 。對馬鈴薯多酚氧化酶的分離純化及酶學性質方面的研究也有見報道［11-13］，但因品種、純化方法不同而有不同結果，純化得到的酶活性偏低，對酶學特性的研究尚不夠全面。本研究選用易褐變的馬鈴薯品種Favorita［14］為研究材料，通過緩沖液提取、硫酸銨分級鹽析和柱層析進行分離純化獲得馬鈴薯多酚氧化酶，并對其酶學性質進行研究，以期完善馬鈴薯多酚氧化酶的純化方法及酶學特性研究，為探索多酚氧化酶對馬鈴薯塊莖發生褐變的作用機制，調控馬鈴薯貯藏和加工過程中的褐變提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1 ??供試材料

1.1.1? 供試樣品? 供試馬鈴薯來自吉林省馬鈴薯研究所的Favorita品種。

1.1.2? 主要試劑? 牛血清蛋白（BSA）標準品（≥96%）、考馬斯亮藍G-250染色液：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、抗壞血酸鈉、檸檬酸、N-BOC-酪胺、綠原酸、鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、間苯二酚、焦性沒食子酸、對苯二酚、咖啡酸、沒食子酸、愈創木酚：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鈉、磷酸：均為分析純，西隴科學股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖凝膠SephadexG-25柱、瓊脂糖凝膠DEAE-FF陰離子交換層析柱、葡聚糖凝膠SephadexG-75柱：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、硫酸銨、無水乙醇：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3? 儀器與設備? 試驗所用儀器主要有分析天平（BSM 120，上海卓精電子科技有限公司）、pH計（ION700，北京索萊寶科技有限公司）、紫外可見分光光度計（UV-1200，上海美譜達儀器有限公司）、金屬?。℉2O3-100C，卡尤迪生物科技宜興有限公司）、臺式高速離心機（3K30，德國Sigma）、電泳儀（E1102，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2? 馬鈴薯多酚氧化酶的分離純化

1.2.1? 馬鈴薯PPO粗酶液的制備? 參考Christoph Eicken等［15］的方法，略做修改。取4℃條件下預冷24 h的新鮮馬鈴薯，清洗干凈后去除表皮，稱取500 g加入已經預冷的200 mL分離緩沖液中（含1.26 g乙酸鈉、0.2 g抗壞血酸鈉、1.17 g氯化鈉，pH 6.0），加入20 g聚乙烯吡咯烷酮，于4℃條件下勻漿，用4層紗布過濾，即得粗酶液。

1.2.2? 硫酸銨分級鹽析? 將硫酸銨研磨成粉狀，緩慢加入到上述制備的粗酶液中，使粗酶液中硫酸銨濃度達到20%飽和度，于4℃下靜置24 h后將混合溶液離心（4℃、15000 r·min-1、20 min），取上清液繼續用30%～80%不同飽和度硫酸銨進行鹽析，測定每次鹽析后上清液中的酶活力。以粗酶液中的酶活力為100%，得到每次測定后的相對酶活力［16］。

1.2.3? Sephadex G-25凝膠柱層析? 使用Sephadex G-25凝膠柱對硫酸銨分級鹽析后的酶液進行脫鹽。用超純水清洗Sephadex G-25凝膠柱，再使用0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）平衡柱子。將分級沉淀后的樣品上樣，洗脫流速為1.0 mL·min-1，測定各管的PPO活性，合并收集酶活性峰。

1.2.4? DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析? 參考滕杰［17］的方法，略做修改。經Sephadex G-25凝膠柱脫鹽后的酶液，上樣于DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱，選用磷酸鹽緩沖液（50 mmol·L-1，pH6.8），流速為1.0 mL·min-1，平衡緩沖液洗脫至完全吸附；接著用NaCl梯度為0～1.0 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（50 mmol·L-1，pH6.8）進行洗脫，流速為1.0 mL·min-1。測定各管的PPO活性和蛋白質濃度。合并收集酶活性峰。

1.2.5? Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析? 參考滕杰［17］的方法，略做修改。使用磷酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 6.8，含0.1 mol·L-1 NaCl）平衡Sephadex G-75凝膠層析柱后，將1.2.4步驟所得樣品上樣，用磷酸緩沖液以1 mL·min-1的速度洗脫。測定各管的PPO活性和蛋白質濃度。最后收集目標酶液濃縮備用。

1.3? 馬鈴薯多酚氧化酶酶學特性分析

1.3.1? 蛋白質含量測定? 采用紫外分光光度法［18］和Bradford法（考馬斯亮藍法）［19-20］測定蛋白質的含量。（1）標準曲線制作：以牛血清蛋白配制標準蛋白溶液，制作標準曲線。（2）蛋白含量測定：按照制作標準曲線的方法測定酶液吸光度值，根據標準曲線上相應蛋白質質量，計算出酶液中蛋白質含量。

1.3.2? PPO酶活力測定? 參考曹健康等［20］的方法，略做修改。取150μL 50 mmol·L-1鄰苯二酚溶液（于pH6.8磷酸緩沖液中溶解），50μL PPO于不同離心管中，在30℃金屬浴上保溫5 min，混合均勻后計時至3 min，記錄反應體系在420 nm處的吸光度值，每30 s記錄1次OD420，制作OD420隨時間變化曲線，根據曲線的初始線性部分計算每分鐘吸光度變化值△OD420［20］。一個酶活力單位定義為：在測定條件下，反應后每分鐘OD420值增加0.001，定義為一個酶活力單位（U）［21］。酶的相對活性定義為：以酶液在最適條件下的酶活力作為100%，其余條件下測得的酶活力與之相比，即為酶的相對活性［21］。酶的比活力定義為：每分鐘1 mg蛋白質OD值增加0.001定義為1個比活力單位，通常使用酶活力和蛋白質含量的比值來表示［22］。

1.3.3? PPO反應進程曲線的制作? 按1.3.2酶活測定體系，150 μL 50 mmol·L-1鄰苯二酚溶液（于pH6.8磷酸緩沖液中溶解）于30℃預熱5 min，取50 μL酶液加入混合均勻后，每隔1 min測1次酶活性，以酶活力（U）表示。

1.3.4? PPO最適溫度的測定? 取50 μL酶液，將反應溫度分別設置為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，按1.3.2的方法測定酶活性，以酶液最適條件下的酶活力作為100%，其余溫度條件下測得酶活力與之相比的相對酶活性表示［23］。

1.3.5? PPO最適pH的測定? 酶反應緩沖液pH值分別設置為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其中0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液用于pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的配制，0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液用于pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的配制。取50μL酶液，按1.3.2的方法測定酶活性，以酶液最適條件下的酶活力作為100%，其余pH條件下測得酶活力與之相比的相對酶活性表示［23］。

1.3.6? PPO最適底物濃度的測定? 設置底物鄰苯二酚濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mmol·L-1，取50 μL酶液，按1.3.2的方法測定PPO酶活性，以酶液最適條件下的酶活力作為100%，其余底物濃度測得酶活力與之相比的相對酶活性表示［23］。

1.3.7? PPO底物特異性試驗? 分別對N-BOC-酪胺、綠原酸、鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚（4-MC）、間苯二酚、焦性沒食子酸、對苯二酚、咖啡酸、沒食子酸、愈創木酚進行底物特異性試驗。配制1 mL 50 mmol·L-1上述底物溶液，另取酶液1 mL，分別加入5 g新鮮馬鈴薯絲中拌勻，記錄4 h后馬鈴薯絲顏色變化情況。

2? 結果與分析

2.1? 馬鈴薯PPO分離純化結果

由圖1可知，當粗酶液中加入20%飽和度濃度的硫酸銨時，上清液中PPO活性達到最高，此時沉淀物中主要為雜蛋白；繼續往上清液中加入硫酸銨，離心后測得上清液中PPO活性逐漸降低；當上清液中加入硫酸銨濃度達到70%～80%飽和度時，離心后測得上清液中PPO活性最低，幾乎不含酶蛋白。本試驗選擇粗酶液中加入20%飽和度的硫酸銨沉淀后，取上清液繼續加入硫酸銨使飽和度達到70%，此時PPO主要存在于沉淀物中。該沉淀物以乙酸鈉緩沖液（50 mmol·L-1，PH 5.5）溶解，用于后續的試驗。

粗酶液經20%～70%的硫酸銨分級沉淀后，去除了一部分的雜蛋白，酶活力雖有一定的降低，但酶比活力則比粗酶液提高1倍。經硫酸銨沉淀后的粗酶液中含有較高濃度的硫酸銨，將影響后續的純化，本試驗采用Sephadex G-25凝膠柱進行脫鹽處理。經脫鹽處理后的PPO采用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱層析進行進一步純化，純化結果見圖示。用含濃度梯度為0～1 mol·L-1 Nacl的磷酸鹽緩沖溶液洗脫后，結果可見1個大的蛋白質洗脫峰，和3個小的蛋白質洗脫峰，酶活性峰位于第1個蛋白質峰和第2個蛋白質峰之間，第1個蛋白質峰的酶活性很低，說明此時洗脫去除了大部分雜蛋白。酶活性峰對應的洗脫液中NaCl濃度約為0.4 mol·L-1，酶比活力從粗酶液的15.2提高到102.3。將活性最高的目標酶液合并濃縮，進行Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析柱純化。

由圖3可見，經Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析洗脫后出現3個蛋白質吸收峰，第1個蛋白質吸收峰與酶活性峰接近重疊。將酶活性最高的目標酶液合并，測得其蛋白質含量為1.0 mg，酶活力為283.0 U，酶比活力為283.0 U·mg-1。整個純化過程完成之后，PPO純化倍數達到18.6，其蛋白質含量和酶活力呈現下降趨勢，酶活力在純化過程有相應的損耗，但經過純化之后目標蛋白濃度升高，說明整個純化步驟，特別是使用DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱層析、Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析的方法是純化PPO的有效方法。

由表1可知，馬鈴薯粗酶液經過硫酸銨分級鹽析、陰離子交換柱層析和G-75凝膠柱層析等步驟進行分離純化后，蛋白質含量大大降低，酶活力明顯下降，但酶比活力顯著升高，說明實驗過程中目標蛋白得以純化。

2.2? 馬鈴薯PPO部分酶學特性

2.2.1? 馬鈴薯PPO的反應進程曲線? 由圖4可知，以鄰苯二酚為底物時，PPO活力隨時間呈對數上漲，在3 min左右，曲率最大，達到最大反應速度，之后趨勢慢慢減小直至逐漸變平和。

圖4? 馬鈴薯PPO的反應進程曲線

Fig.4? Reaction process curve of potato polyphenol oxidase

2.2.2? 馬鈴薯PPO的最適反應溫度? 隨著溫度升高，酶促反應速率加快，使酶活性提高；另一方面，過高的溫度也會使酶蛋白變性，破壞酶活性部位三維結構的完整性和穩定性，促使酶活力下降［24-25］。溫度對馬鈴薯PPO活性的影響如圖5所示。馬鈴薯PPO酶活性在20～30℃時，隨溫度升高逐漸增強，30℃時活性最高；30～60℃時，酶活性隨溫度升高快速下降，表明在此溫度階段抑制馬鈴薯PPO的活性最為有效；80℃時酶活性趨近于0。以鄰苯二酚為底物時，馬鈴薯PPO在20～35℃期間有較高活性。最適反應溫度為30℃，與人參果相同［9］，但高于鴨梨果肉（25℃）［26］，低于桑葉（40℃）［27］。

圖5? 溫度對馬鈴薯PPO活性的影響

Fig.5? Effect of temperature on the activity of potato polyphenol oxidase

2.2.3? 馬鈴薯PPO的最適反應pH值? pH值是影響酶活性的重要因素，pH值通過影響酶構象的改變而產生對酶活性的影響［28］，pH值偏高或者偏低會造成酶結構中Cu2+的解離及蛋白質變性。由圖6可知，馬鈴薯PPO在pH 3.0～6.0時，酶活性隨著pH值的上升逐漸增強，在pH 6.0～6.5時酶活性達到高峰，在pH 6.5時酶活性最高；在pH 6.5～7.0時酶活性隨著pH值的上升受到強烈抑制，從100%迅速降低到15%，表明pH值在6.5～7.0階段抑制馬鈴薯PPO的活性最為有效；pH 7.0之后酶活性變化不大。由此可知，以鄰苯二酚為底物時，馬鈴薯PPO在pH 6.0～6.5之間活性最高，馬鈴薯PPO最適反應pH為6.5，這與香菜葉［29］和甘薯葉［30］相同，高于洋薊頭（pH 6.0）［31］，稍低于蒲菜（pH 6.8）［32］ 。最適pH值的研究為馬鈴薯貯藏及加工條件的進一步優化提供理論依據。

2.2.4? 馬鈴薯PPO最適底物濃度? 底物濃度對酶活性的影響見圖7?？梢钥吹降孜餄舛仍?0～50mmol·L-1范圍內，馬鈴薯PPO活性隨底物濃度的上升逐漸升高，底物濃度達到50 mmol·L-1時酶活性最大；當底物濃度繼續升高時，酶活性不變。由此可知，以鄰苯二酚為底物時，馬鈴薯PPO的最適底物濃度為50 mmol·L-1。

2.2.5? 馬鈴薯PPO的底物特異性? 由圖8可知，與對照組（無處理）相比，N-BOC-酪胺、綠原酸、鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、間苯二酚、焦性沒食子酸、對苯二酚、咖啡酸、沒食子酸、愈創木酚與馬鈴薯絲混合，于25℃下4 h后顏色均發生不同程度的變化，說明上述10種底物均可與馬鈴薯PPO發生酶促反應。

由圖9可知，馬鈴薯PPO對間苯二酚、焦性沒食子酸的底物親和性較強，相對酶活分別為100%和90%，對4-甲基兒茶酚、咖啡酸、沒食子酸、對苯二酚、鄰苯二酚、綠原酸的底物親和性較低，相對酶活均為20%以下，對N-BOC-酪胺、愈創木酚則無親和性。這表明馬鈴薯PPO主要的反應底物為二酚類的間苯二酚和三酚類的焦性沒食子酸。

3? 結論與討論

酶的分離純化研究是進一步進行酶學性質研究、開發相應的抑制劑及酶學應用研究的基礎。該試驗研究分離純化得到馬鈴薯PPO，酶比活力為 283.0 U·mg-1，酶回收率為16.8%，純化倍數為18.6。這一研究結果與李潔媛等［13］通過透析和陰離子交換層析分離純化得到的結果相比，比活力明顯更高，回收率則較低，純化倍數略高一些；由此分析純化方法及條件的不同會影響目標蛋白純化倍數、回收率。分析回收率偏低的原因可能是由于純化操作過程的損耗，該純化條件有待于進一步優化。

酶學特性研究顯示，馬鈴薯PPO在以鄰苯二酚為底物時，最佳底物濃度為50 mmol·L-1，在3 min時反應速率最大，10 min左右逐漸趨于平緩。馬鈴薯PPO在20～35℃活性相對穩定，35～60℃活性呈迅速下降的趨勢，最適反應溫度為30℃；在pH 6.0～6.5活性為最佳，最適pH值為6.5? 。該試驗結果與李俊等以Favorita馬鈴薯為材料，用磷酸鹽緩沖液提取獲得的PPO酶學性質相同［12］。與Rasmussen等以磷酸鹽、乙酸鹽混合體系提取，經Hi-trap親和層析柱純化后的馬鈴薯PPO最佳反應溫度為40℃，最適反應pH為5.0的結果不一致［11］；與李潔媛等［13］的研究結果（最適pH為6.0）、孟雅等［33］的研究結果（最適pH為7.0）也有差異，可能是由于品種不同，純化方法也有差異。馬鈴薯PPO與間苯二酚、焦性沒食子酸有最強的底物親和性，其次是4-甲基兒茶酚、咖啡酸、沒食子酸、對苯二酚、鄰苯二酚、綠原酸，對N-BOC-酪胺、愈創木酚親和性極低。馬鈴薯中存在一定量的酚類物質，綠原酸是其中最主要的酚類物質［34］，但試驗結果顯示綠原酸與馬鈴薯PPO的親和性并不高。由馬鈴薯PPO的底物特異性研究可知酚類物質的種類、數量、分布都會影響與馬鈴薯PPO的反應活性，從而造成不同品種馬鈴薯褐變情況的差異。上述研究結果表明，可通過調節pH值、低溫貯藏并結合低溫貯藏前進行短時間的熱處理、根據底物特異性差異開發褐變抑制劑等方法來使馬鈴薯多酚氧化酶在貯藏、加工過程保持較低的酶活性，從而控制馬鈴薯的褐變。

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（責任編輯：林玲娜）