篩選鑒定CD44v9特異性結合肽并用于胃癌檢測的研究

張 丹,馮 云,劉亞萍,趙 倩,黃 晉,和水祥

(1.西安交通大學第一附屬醫院消化內科,陜西西安 710061;2.陜西科技大學電子信息與人工智能學院光電系,陜西西安 710021)

腫瘤的早期診斷是目前腫瘤研究的重要方向。分子影像通過對活體的生物學過程在細胞和分子水平進行的描述和測量實現疾病的早期篩查[1]。隨著各種影像學技術的發展,目前分子影像學診斷的關鍵是選擇合適的靶分子及獲得針對靶分子的特異性親和探針。CD44是目前已明確的胃癌標志物,尤其是可變型外顯子編碼區CD44v,相對CD44固有型外顯子編碼區CD44s,具備更高的腫瘤特異性。CD44v中,CD44v6靶向藥物開發較多,部分已進入臨床試驗。而CD44v9作為CD44家族中高特異性結構域,尚缺乏相應的探針開發。本團隊致力于胃癌多肽探針的開發,曾經使用噬菌體多肽展示技術對CD44s、CD44v6進行篩選并獲取多肽探針,發現單一探針在信號強度、靈敏性、特異性方面尚存在較大的提升空間。因而,針對高特異性腫瘤標志物的探針,對加強腫瘤灶信號、提升早癌檢出率有重要意義。本研究使用CD44v9 為靶點,開發并驗證其特異性配體多肽序列。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海細胞庫,人胚腎HEK-293 細胞購自美國菌種保藏中心。CD44v9外顯子編碼區由上海強耀生物科技有限公司合成,噬菌體展示12肽庫購自美國New England Biolabs公司。

1.2 噬菌體展示肽庫篩選

1.2.1篩選 分別將10 g/L BSA 或100μg/m L CD44v9溶于8.4 g/L Na HCO3(p H 8.4),加入至酶標板,4℃過夜。加入30 g/L BSA 封阻滿孔,孵育2 h。使用TBS(10 mmol/L Tris,p H 7.4)將10μL噬菌體展示肽庫(New England Biolabs,US)稀釋至100μL,加入10 g/L BSA孔內,37℃搖動孵育2 h。將10 g/L BSA孔內未結合的噬菌體上清加入100μg/mL CD44v9孔內,37℃搖動孵育2 h。后去除未結合噬菌體上清,0.1%TBST(Tween-20 1 g/L)洗板10次。后將100μL洗脫緩沖(0.2 mol/L Glycine-HCl p H 2.2,1 mg/m L BSA)加入CD44v9孔內作用15 min,取出洗脫液,使用15μL 中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl p H 9.1)中和。

1.2.2擴增滴定 復蘇E.coliER2738,培養至對數期,取1μL后將上一步所獲取噬菌體洗脫液進行滴定。將洗脫液使用LB 液體培養基分別稀釋至10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋度,分別依次與菌液、3 m L 頂層瓊脂糖迅速混勻,后加至LB/IPTG/Xgal固體培養基平板。37℃培養,次日選擇含有102數量級藍色噬菌斑的平板進行計數。計算回收率:回收率=回收噬菌體/投入噬菌體。

將1.2.1步驟中所獲得全部噬菌體洗脫液加入20 m LE.coliER2738對數期菌液中,225 r/min振蕩培養,37℃、4.5 h,培養物使用4℃10 000 r/min離心10 min,使用PEG/NaCl 4℃過夜沉淀噬菌體,4℃10 000 r/min 離心15 min,棄上清,沉淀使用TBS重懸,重復上述沉淀過程,最終沉淀使用200μL TBS 0.2 g/L NaN3噬菌體保存液溶解,為次級庫,對次級庫按上述方法再進行滴定。

1.2.3后續篩選 重復步驟1.2.1,進行后續3輪淘選,其中所加噬菌體文庫為上一輪所獲得次級庫,洗滌液中Tween濃度增加至5 g/L。每輪淘選結束按照1.2.2方法進行滴定及擴增至次級庫。對第4輪洗脫物不擴增,僅進行滴定。

1.3 測序

1.3.1噬菌體單克隆化 從第4輪篩選滴定的平板中選擇102水平平板,隨機挑取30個藍斑,即噬菌體單克隆。將E.coliER2738菌液在37℃、225 r/min條件下振蕩培養4.5 h至對數期。將每個噬菌體單克隆加入1 m L 上述菌液中,繼續按上述條件培養6 h,將培養物離心,收集上清為噬菌體單克隆貯液。

1.3.2噬菌體DNA 提取及測序 將500μL噬菌體單克隆貯液加入200μL PEG/NaCl,4℃沉淀噬菌體10 min,高速離心后去除上清。將沉淀使用100μL碘化物緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,4 mmol/L NaI)重懸,再加入250μL 無水乙醇常 溫沉淀DNA?；旌衔锔咚匐x心10 min,去除上清,用700 m L/L的乙醇漂洗沉淀,短時真空干燥。最終將沉淀使用TE 緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)30μL重懸。

取上述噬菌體單克隆DNA 貯液,送上海生工生物工程公司,使用-96gⅢ測序引物(5＇-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3＇)行全自動測序。根據噬菌體多肽展示文庫附帶使用手冊對噬菌體測序結果進行讀取及翻譯。

1.4 ELISA鑒定候選噬菌體

將噬菌體單克隆進行常規擴增滴定。分別將10 g/L BSA 或100μg/m L CD44v9 溶 于8.4 g/L Na HCO3(p H 8.4),加入至酶標板,4℃過夜。加入30 g/L BSA 封阻滿孔,孵育2 h。每組設置3個復孔。每組分別加入1011待測克隆或對照克隆,37℃孵育1 h,0.5%TBST 洗板6次。加入封阻液稀釋的山羊抗M13噬菌體衣殼蛋白多克隆抗體(1∶1 000,Santa Cruz,US),37℃孵育1 h,常規洗滌后再加入封阻液稀釋的HRP 標記兔抗山羊抗體(1∶5 000,Bioss,CN),37℃孵育1 h,常規洗滌。TMB 顯色試劑盒顯色,使用酶標儀在波長450 nm 處讀取吸光度。計算選擇力,即CD44v9孔A值/BSA 孔A值。

1.5 多肽合成

將選擇的多肽序列,連同亂序對照序列,由多肽合成儀合成(上海強耀生物技術公司),氮端標記羅丹明或生物素。純度95%以上,合成產物由高分液相色譜鑒定。

1.6 細胞免疫熒光

在前期工作中,已驗證人胚腎HEK-293細胞僅表達野生型CD44s,不表達CD44v[2],并構建CD44v3-v10重組質粒并驗證在HEK-293細胞中過表達[3]。重組CD44v 質粒及空載質粒使用脂質體(Invitrogen,US)轉染至HEK-293細胞。制備細胞爬片,去除培養基,PBS洗滌3次,加入40 g/L 多聚甲醛固定液,于4℃固定15 min,常規洗滌。30 g/L BSA 37℃封閉30 min,洗滌后加入封閉液稀釋的FITC標記待測多肽及對照多肽(10μmol/L),37℃孵育10 min,PBS洗滌,加入DAPI染核5 min,洗滌后甘油封片,熒光顯微鏡拍照。

1.7 免疫組化檢測探針與人胃癌組織結合

人胃癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司,芯片包含23例首診胃癌組織及相應的癌旁非癌組織。術前未進行過放化療、生物治療等腫瘤相關治療。置組織芯片于烘箱60℃烘烤20 min,后浸泡于二甲苯中20 min,梯度乙醇水化。置于TE 緩沖液(p H 9.0)于微波爐內加熱行抗原修復。3%H2O2去除內源性過氧化物酶活性。5%FBS 37℃封閉1 h。實驗組滴加生物素標記多肽探針(10μmol/L),對照組滴加封閉液稀釋的小鼠抗人CD44單克隆抗體(1∶100,Santa Cruz,US),后續以生物素標記山羊抗小鼠抗體(1∶500,Bioss,CN)。所有芯片滴加封閉液稀釋的HRP標記鏈霉親和素(1∶200),37℃孵育1 h。DAB試劑盒顯色,蘇木素復染細胞核,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察切片,統計染色得分,具體方法如下:著色細胞占總細胞比例0、0～10%、10%～50%、50%～80%、80%以上分別記0、1、2、3 分;著色強度記為1 分(淺著色)、2分(中等著色)及3分(強著色);將著色細胞數量比例得分與著色強度得分相乘所得即為染色得分。一個標本中任選5個高倍視野進行統計,最終該標本染色得分為5個分數均值。

1.8統計學處理

實驗結果采用SPSS 19.0(SPSS,US)進行統計分析。計量數據表示為均數±標準差,計量數據組間差異比較采用t檢驗,變量間關聯采用Perason相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 噬菌體展示肽庫篩選

為了篩選與CD44v9結構域編碼區結合的特異性多肽配體。CD44v9 外顯子編碼區純化蛋白被包被至固相表面(酶標板)作為篩選靶點。1011數量級的噬菌體文庫,包含109級別復雜度,首先與包被BSA 的陰性篩選孔結合,未結合噬菌體被投入CD44v9包被孔內進行篩選。每輪篩選后,對獲得的噬菌體進行擴增,可以使優勢噬菌體進行指數級別的富集。每輪篩選的回收率,即回收噬菌體/投入噬菌體,是篩選是否成功的參數。表1 示4 輪篩選的投入、回收、回收率數值?？梢?隨著篩選進行,在投入噬菌體數量級穩定的情況下,回收噬菌體及回收率的數量級呈現升高,經統計學檢驗發現,相鄰輪次回收率兩兩比較,差異存均在統計學意義(P＜0.05)。圖1反應了4輪篩選回收率呈現的趨勢,說明在篩選過程中,優勢克隆富集情況明顯,篩選有效。

圖1 4輪噬菌體篩選回收率Fig.1 Recovery rates of four rounds of screening

表1 4輪篩選的投入、回收噬菌體及回收率Tab.1 Input phages,output phages and recovery rate of four rounds of pannings

2.2 噬菌體序列分析

在篩選結束后,對收取噬菌體進行滴定,隨機選取30個噬菌體克隆進行測序。通過限制性內切酶位點進行插入DNA 定位,后通過M13 噬菌體密碼子表進行翻譯,可獲得噬菌體所攜帶的多肽序列。在30個噬菌體單克隆中,如表2所示,出現序列重復富集現象,其中重復次數最高的序列為C9-3,共10次,其余序列 有C9-1(1 次)、C9-2(6 次)、C9-4(2 次)、C9-5(4次)、C9-6(3 次)、C9-7(1 次)、C9-8(2 次)、C9-9(1次)。重復次數多的序列相較重復序列少的序列親和力及特異性更優的概率更大,是序列選擇的重要參考標準。

表2 噬菌體序列、重復情況及選擇力Tab.2 Amino acid sequences,frequency and selectivity of screened peptides

2.3 噬菌體序列ELISA鑒定

噬菌體ELISA 用于鑒定待測序列,尋找高親和力及選擇性的噬菌體克隆。所有待測序列,包括隨機對照序列克隆(unrelated random phage,Urps)均與CD44v9包被孔(靶蛋白)及BSA 包被孔(對照蛋白)進行結合檢驗。圖2展示了噬菌體ELISA 的檢驗結果。噬菌體與CD44v9結合的吸光度絕對值代表結合的親和力?？梢娢舛冉^對值最高的5個序列按順序分別為C9-3、C9-2、C9-5、C9-1、C9-6,其中C9-3、C9-2兩個克隆絕對值超過1.5。表2展示了所有待測序列的選擇力,即噬菌體與靶蛋白、對照蛋白吸光度比值,這代表了噬菌體與靶蛋白結合的特異性?？梢娺x擇力最高的5個序列按順序分別為C9-3、C9-5、C9-2、C9-6、C9-1,其中C9-3、C9-5兩個克隆選擇力大于4。綜上,C9-3序列具備最佳的親和力及特異性,同時也是重復率最高的序列,因此被選擇為探針序列進行合成檢測。

圖2 噬菌體克隆ELISA鑒定結果Fig.2 ELISA of each individual phage clone

2.4 多肽探針檢測細胞表面CD44v9

羅丹明標記的C9-3 多肽分別用于檢測CD44v過表達細胞及空質粒轉染對照細胞。如圖3 展示,C9-3多肽結合于CD44v過表達的HEK-293 細胞,熒光信號明顯高于空質粒轉染的HEK-293 細胞。羅丹明標記的亂序對照肽用于結合CD44v過表達的HEK-293細胞時,也未發現明顯的熒光信號。

圖3 C9-3多肽與CD44v9表達情況不同的HEK-293細胞結合情況Fig.3 Binding of C9-3 peptide to HEK-293 cells with different CD44v9 expression

2.5 多肽探針檢測胃癌組織表面CD44v9

圖4A 展示了胃癌組織中C9-3探針與CD44v9抗體染色情況,可見棕色著色位于細胞膜及細胞質中,分布位置基本一致。圖4B 為組化評分統計圖。多肽探針結合胃癌組織組化評分為5.09±3.84,癌旁組織為2.01±0.85,二者間存在統計學差異(t=3.953,P＜0.01)。23例胃癌組織中,有11例(47.83%)經多肽探針結合呈強染色,10 例(43.48%)經CD44v9免疫組化檢測結果為高表達,其中9例二者均為強染色。癌旁組織中,未發現探針強染色及CD44v9高表達。如圖4C 所示,經線性回歸分析顯示,C9-3探針染色及CD444v9免疫組化評分間存在線性正相關關系(r=0.823,P＜0.01)。

圖4 C9-3多肽探針與胃癌及相應癌旁組織結合情況Fig.4 Binding of C9-3 peptide to gastric cancer and corresponding paracancerous tissues

3 討 論

CD44是重要的腫瘤標志物,其通過不同的剪切表達,分子結構主要分為標準型CD44(CD44s)及可變型CD44(CD44v)。CD44分子為跨膜糖蛋白,包含有胞外段、跨膜段、胞內段3個部分,其中胞內段與跨膜段位于碳端,高度保守,編碼區位于CD44基因的18、19、20號外顯子。胞外段由1至17號外顯子編碼,包括有CD44分子生理功能區域——透明質酸結合域,以及v1-v10可變型外顯子編碼區域,由于可變性外顯子存在多種剪切形式,因此CD44v分子種類繁多,胞外段長度可在200～700氨基酸不等[4]。

CD44分子是具備重要生理功能的細胞黏附分子及淋巴調節因子,但生理功能多與CD44s中所包含功能區相關。CD44v更多被研究的是其與腫瘤的關系。Rho A 與CD44v3形成復合物后,會激活Rho激酶,并磷酸化包括CD44v3、CD44v8-v10在內的幾種蛋白,促使這些CD44分子與錨蛋白結合,從而調控腫瘤發展[5]。CD44v9 可以通過穩定雄激素受體誘發抗凋亡效應[6]。CD44v6可以與HGF形成復合物并將其呈遞至受體,引發受體激酶樣效應并激活Ras等下游通路,HGF 可以引發多種腫瘤的轉移效應;HGF 經IFG-1、TGF-β、PEG-2 及 腫 瘤 壞 死 因 子激活可以刺激CD44v9 的產生[7]。CD44v7-v10 因MAPK 通路重要因子MEK、p38被抑制后同樣出現轉錄水平的抑制[8]?？梢园l現,CD44v促進腫瘤機制的研究中,CD44v9是報道比較多的CD44v分子。

CD44是重要的胃癌標志物,在胃癌中的表達較正常胃黏膜組織明顯上升。CD44 在正常胃黏膜中表達較少,而在癌前狀態包括慢性萎縮性胃炎及腸化黏膜中表達局限于基底腺上皮細胞,癌組織中表達明顯升高[9]。胃癌中關于CD44v的表達情況報道較多的是CD44v6,目前也有關于CD44v6的配體藥物開發報道[10]。CD44v9被證實在胃癌組織中表達高于非癌組織[11-12];且有報道發現,CD44v6 在正常胃黏膜中有表達,但CD44v9不表達于HP陰性正常胃黏膜,提示CD44v9 具備更高的腫瘤特異性[13]。目前現有研究中,尚缺乏CD44v9的探針開發。

分子影像中成像技術已有高水平發展,可以滿足閃爍掃描、光學、磁共振、超聲等多平臺分子水平成像,但目前制約分子影像學臨床應用的原因是缺乏高靈敏、高特異、能產生明確病灶信號,并且穩定、經濟的配體探針。本課題組曾通過噬菌體多肽展示技術,篩選并鑒定多條針對于CD44s、CD44v 的多肽探針[2-3,14]。發現單一探針在信號強度、靈敏性、特異性方面可能不足以滿足臨床要求。因而,使用不同靈敏度、特異性的探針進行復合,可以克服單一探針存在問題,在實際工作中達到提高檢出率及檢出特異性的目的。

因為本次篩選目標是高特異性腫瘤標志物CD44v9,因此保證探針的高特異性是本次篩查的重點。對于靶點,我們選擇v9外顯子合成區進行合成,最大程度避免其他結構的混入。篩選方面使用了陰性消減,減少非特異性噬菌體的結合。篩選過程中及篩選后的測序體現出了噬菌體的富集作用。后通過ELISA 驗證,獲得了最佳序列。經驗證該序列的合成肽,可以特異性結合于CD44v過表達HEK-293細胞。一方面證實C9-3噬菌體被篩選是因為其表達肽的結合而非噬菌體非特異性結合;另一方面也證實了C9-3多肽不僅結合于固相包被的CD44v9,也可以結合于細胞表面表達的CD44v9。

通過對胃癌組織的結合,C9-3 多肽的診斷價值被進一步驗證。相對我們在以往工作中所篩選的CD44s、CD44v6 探針,C9-3 在胃癌組織中的陽性率相對較低,但在癌旁非癌組織中,無一例陽性,明顯低于我們既往獲得探針,證明C9-3探針與其靶點一致,是胃癌的高特異性探針。因此,在后續工作中,幾條探針將被用于復合檢驗腫瘤,以求達到臨床中需求的檢測強度及檢測特異性。