白花蛇舌草總黃酮對肝細胞癌干細胞增殖及凋亡的影響

姚博文,李亞昭,廖子君,魯 葉,張 祥,馬婕群,李 倩,張彥兵

(1.西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科,陜西西安 710061;2.西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心,陜西西安 710061;3.陜西省腫瘤醫院腫瘤內科,陜西西安 710061;4.西安交通大學附屬兒童醫院心電診斷科,陜西西安 710003)

肝癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一,肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占全球原發性肝癌的80%以上[1]。全球肝癌發病人數為91萬,占所有癌癥的4.7%,在癌癥發病率中排名第六位,死亡人數在全球排名第三位,且發病率呈逐年上升趨勢[2]。

肝癌干細胞(liver cancer stem cells,LCSCs)是HCC中具有自我更新、分化和腫瘤發生能力的一小部分腫瘤細胞,與腫瘤的增殖、轉移、復發及化療耐藥等腫瘤惡性進程具有密切的關系[3-4]。目前已被鑒定的肝癌干細胞標志物包括CD133、EpCAM、CD44、CD13、CD90、CD24、CD47和OV6等[3]。其中,CD133與HCC患者的分級、分期、甲胎蛋白(AFP)水平、生存周期及復發等具有顯著相關性[5-7]。同時,CD133的抗原能夠在Huh7細胞系表面表達,并且來自Huh7細胞系的CD133+細胞具有更高的體外增殖、分化、致瘤及血管生成能力[8-9],是流式分選Huh7 細胞中LCSCs常用的分子標志物。

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)為茜草科耳草屬植物,白花蛇舌草總黃酮(total flavone of oldenlandia diffusa,FOD)是其重要的活性提取物之一。前期研究已經證實,FOD 對HCC的增殖及上皮間質轉化具有顯著抑制作用[10-11]。同時,其對肺癌干細胞、大腸腫瘤干細胞等均具有抑制作用[12-14]。

本研究對肝細胞癌細胞系Huh7中肝細胞癌干細胞標志物CD133 陽性的細胞群(CD133+-Huh7)進行流式分選,探究FOD 藥物刺激對CD133+-Huh7細胞增殖及凋亡的影響,為FOD 在HCC臨床治療中的應用提供新的依據及研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Huh7細胞購買自中國科學院細胞庫。DMEM高糖培養基、細胞胰酶、胎牛血清(FBS)購自Hyclone,CD133流式抗體購自Biolegend;青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 溶液、細胞蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、BSA 購自碧云天生物試劑;CCK-8 檢測液、ECL 發光液購自新賽美生物;Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購自BD;一抗β-actin、Bcl-2、Nanog、Caspase3、FAS、FADD、P53及二抗購自武漢三鷹;Bax、Oct4、Sox2 一抗購自Santa Cruz公司。細胞培養箱(賽默飛);超凈工作臺(海爾);MoFlo XDP超速流式細胞分選儀(貝克曼);流式細胞分析儀(BD);多功能酶標儀(Enspire);垂直電泳系統、轉膜儀、ECL發光儀(伯樂)。

1.2 FOD的提取

取白花蛇舌草藥材粗粉50 g,加入500 mL石油醚回流提取1 h,濾過,藥渣揮干石油醚,加700 m L/L乙醇500 m L,回流提取1.5 h,濾過,濾液減壓回收至約50 m L后,D101樹脂柱上樣,分別用水和100、300、500 m L/L 乙醇洗脫后,收集500 m L/L 乙醇洗脫液,加壓回收乙醇至約10 m L,聚酰胺柱上樣,分別用水和100、300、500、700 m L/L 乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓濃縮,干燥即得。

1.3 細胞培養

將凍存的Huh7細胞放入37℃水浴鍋中快速解凍,迅速移入10 m L含有100 m L/L FBS的DMEM高糖培養基中,輕柔混勻后轉入細胞培養皿中。在37℃,50 m L/L CO2細胞培養箱中進行培養。待細胞生長匯合達到約90%時,用細胞胰酶消化液消化1 min后,加入等體積的完全培養基終止消化,1 000 r/min離心5 min,棄上清,輕柔重懸細胞沉淀后進行1∶3傳代。

1.4 細胞免疫熒光染色及干細胞的流式分選及鑒定

將對數生長期Huh7 細胞匯合至約80%時,用胰酶消化成單細胞懸液,PBS溶液漂洗2次去除殘留培養基。加入100μL PBS 溶液重懸細胞后,加入5μL CD133抗體,37℃避光孵育30 min。PBS溶液漂洗后,加入1 m L PBS溶液重懸細胞,使用單細胞篩網進行過濾,通過MoFlo XDP超速流式細胞分選儀對CD133+細胞進行流式分選,獲得純化Huh7干細胞。取部分獲得分選細胞培養并再次染色后,使用流式細胞術檢測CD133陽性細胞比例。

Western blotting 檢測所獲取分選細胞CD133陽性細胞的干性標志物Nanog、Sox2及Oct4的相對表達。將分選后的CD133+細胞收集于含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 溶液的完全培養基中,進行后續培養。

1.5 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法 檢 測FOD 對 分選細胞的增殖抑制率

將純化的CD133+Huh7細胞以500個/孔的密度加入96孔板中,移入細胞培養箱中過夜培養使其貼壁,分別用0、50、100、400μg/m L FOD 干預24、48、72、96 h,進行CCK-8實驗檢測。向每孔中加入10μL CCK-8檢測,37℃孵育2 h,用多功能酶標儀檢測吸光度A450nm值。根據抑制率公式計算抑制率,公式如下:抑制率(%)=(Acontrol-Asample)/(Acontrol-Ablank)×100%(control代表對照組即加入細胞未加藥品組,blank 為空白對照即未加細胞和藥品組,sample代表加入細胞及藥品檢測組)。

分選的Huh7干細胞分別用0、50、100、400μg/mL處理,根據細胞生長抑制率曲線,選取合適濃度(經實驗后選用100μg/m L)的FOD 處理組為實驗組(后文稱為FOD 組),0μg/m L FOD 處理組為對照組(后文稱為DMSO 組)。

1.6 平板克隆實驗

取分選后的對數生長期CD133+-Huh7 細胞,1 000/孔種于6孔細胞培養板中,FOD 組和DMSO組細胞培養10 d,棄去細胞培養基,PBS溶液輕柔清洗2遍,吸干殘余液體,每孔加入2 m L 100 m L/L甲醛溶液固定細胞20 min后棄去,PBS溶液輕柔清洗2遍,加入結晶紫溶液染色10 min。棄去染料后清洗5遍。風干培養板后,顯微鏡下拍照并計數。

1.7 Annexin V-PE/7-AAD法檢測細胞凋亡

將對數生長期的FOD 組和DMSO 組CD133+-Huh7細胞,胰酶消化成單細胞懸液,用PBS溶液漂洗2次,加入100μL稀釋好的binding buffer重懸細胞后,分別加入5μL Annexin V-PE及7-AAD,37℃避光孵育30 min 后,加 入500μL 稀 釋 好 的binding buffer,使用單細胞篩網進行過濾后使用流式分析儀進行檢測。

1.8 Western blotting檢測凋亡相關蛋白表達

將FOD 組及DMSO 組細胞,使用蛋白裂解液提取總細胞蛋白,BCA 法檢測蛋白濃度并變性蛋白后,進行SDS-PAGE 電泳后,轉印至PVDF 膜,經BSA封閉,一抗(細胞凋亡標志物Bcl-2、Bax 及Cleaved-Caspase3及凋亡相關通路蛋白P53、FAS及FADD)、二抗孵育后,進行ECL發光。

1.9 統計學處理

實驗數據分析采用SPSS v19.0及GraphPad作圖軟件自帶分析完成。分別完成3次獨立重復實驗,實驗數據匯總后,A 值、蛋白電泳條帶掃描后灰度、凋亡細胞百分比、平板克隆細胞集落數采用方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞的分選情況

使用CD133抗體對Huh7細胞進行流式免疫熒光染色分析發現,CD133+-Huh7細胞比例為40.2%(圖1A)。對CD133+的Huh7 細胞執行分選后培養,經此純化后的CD133+細胞比例為98.2%(圖1B)。Western blotting實驗證實純化后的CD133+-Huh7干性指標Nanog、Sox2及Oct4的表達較分選前更高(圖1C)。

圖1 流式分選并純化CD133+-Huh7細胞及其鑒定Fig.1 Fluorescence-activated cell sorting and purifying C D133+-Huh7 cells

2.2 FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示,以50、100、400μg/m L FOD 刺激CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞不同時間后,其增殖能力均被一定程度抑制,400μg/m L 的FOD刺激CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞96 h,細胞增殖抑制程度最為顯著(圖2,P＜0.01)。綜合考慮藥物的抑制率及濃度增高的副作用,選擇100μg/m L FOD 作用72 h(FOD 組)進行后續實驗。平板克隆實驗結果顯示,FOD 組的Huh7 細胞增殖能力較DMSO 組減弱(圖3,P＜0.01)。

圖2 各濃度FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞不同作用時間的抑制率比較Fig.2 The inhibition rate of FOD on CD133+-Huh7 detected by CCK-8

圖3 平板克隆實驗觀察FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞增殖的影響Fig.3 The effect of FOD on CD133+-Huh7 proliferation

2.3 FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞凋亡的影響

Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測結果顯示,100μg/m L的FOD 作用CD133+-Huh7干細胞凋亡水 平 顯 著 升 高(P＜0.01),DMSO 組 和FOD 組CD133+-Huh7的細胞凋亡比例分別為(6.775±1.018)%vs.(16.55±1.212)%(圖4)。

圖4 FOD對CD133+-Huh7干細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of FOD on CD133+-Huh7 cell apoptosis

Western blotting檢測結果顯示,相較于DMSO組,FOD組抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低,而促凋亡蛋白Bax、片段化的Caspase3升高(P＜0.05,圖5)。

圖5 FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞Bcl-2、Bax及Caspase3蛋白表達的影響Fig.5 The effect of FOD on CD133+-Huh7 Bcl-2 and Bax and Caspase3 protein expressions

以 上 結 果 證 明,100μg/m L 的FOD 能 夠 促 進CD133+-Huh7細胞凋亡。

為進一步探究引起Huh7細胞發生凋亡的上游通路,根據經典的凋亡家族蛋白上游通路篩檢,發現FOD 可以顯著上調FAS、FADD 以及經典抑癌通路關鍵蛋白P53(P＜0.05,圖6)。據此推測,FOD 激活Huh7細胞發生凋亡的潛在上游機制可能為P53-Bax以及FAS-FADD-Caspases家族蛋白共同作用的強效促凋亡機制。

圖6 FOD對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞p53/FAS-FADD通路蛋白表達的影響Fig.6 The effect of FOD on CD133+-Huh7p53/FAS-FADD axisprotein expression

3 討 論

肝細胞癌是最致命的惡性腫瘤之一,具有高度的腫瘤異質性,并且其發病率呈逐年上升的趨勢[15]。我國是乙肝大國,同時也是肝癌大國,肝癌新發病例數和死亡病例數均位列全球第一[16]。目前肝癌治療的主要手段包括手術切除[17]、肝臟移植[18]、射頻消融[19]、經動脈介入治療[20]、細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4及程序性死亡受體-1等單抗或抑制劑免疫治療[21-22]、索拉非尼及侖伐替尼藥物靶向治療[23-24]等。然而,由于LCSCs的存在,導致HCC的轉移、復發及耐藥風險大幅升高[3-4]。

FOD 作為白花蛇舌草中重要的活性提取物之一,能夠對肺癌干細胞的增殖、凋亡及細胞周期產生影響[12],能夠通過Wnt信號通路抑制結腸腫瘤干細胞分化[13],并且在結腸癌中能夠通過調控Wnt/βcatenin通路抑制干細胞的生長[14]。然而其對肝細胞癌干細胞的作用未見報道。本研究通過流式分選成功分離出CD133+-Huh7 肝細胞癌干細胞,并將FOD 作用于該細胞,觀察FOD 對CD133+-Huh7肝細胞癌干細胞增殖及凋亡的影響。結果顯示,FOD能夠對CD133+-Huh7 肝細胞癌干細胞增殖產生以劑量及時間依賴性抑制,同時,FOD 使其凋亡水平顯著升高,且抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表達發生變化,這為FOD 在治療復發型、轉移型及耐藥性HCC方面提供理論依據。

參與干細胞凋亡的蛋白眾多。本研究所涉及的凋亡蛋白為線粒體凋亡家族蛋白,為凋亡蛋白的主要分支。FOD 是否參與Caspase家族其他蛋白及細胞壞死、細胞衰老相關家族蛋白仍需后續研究。為初步明確激活干性肝癌細胞凋亡的潛在上游,通過篩檢凋亡通路蛋白發現P53、FAS-FADD 通路被FOD 激活,因此,有理由相信下游的Caspase 家族蛋白及Bax/Bcl家族蛋白表達變化與上游通路激活有關。然而,FOD 對干細胞凋亡通路的激活機制尚不清楚,目前發現的仍然只是表型和部分潛在機制,有關抑制增殖、促進凋亡的關鍵通路仍是未知,將在后續的研究中揭示。

研究肝細胞癌干細胞活性及機制,探索抑制肝細胞癌干性細胞的藥物及治療手段成為解決肝細胞癌治療耐藥及延長患者生存期的關鍵環節。本研究雖然提出FOD 抑制肝細胞癌干細胞活性的科學假設,并初步探討抑制干性細胞增殖、促進其凋亡的潛在作用,但干細胞活性受多種因素影響,其凋亡亦受到腫瘤微環境、物理化學刺激等多種外因調節,干細胞活力下降且凋亡增加是否由FOD 單一因素引起仍需要更為嚴謹的科學實驗進一步探究。本研究首次發現FOD 對肝細胞癌干細胞的顯著抑制作用,將可能為一線治療耐藥的患者提供指導和幫助,與靶向藥物、化療藥物、免疫治療藥物等聯合使用FOD 或將增加對耐藥細胞的殺傷作用。在祖國醫學快速發展的今天,中西醫結合理念及產品成為解決關鍵技術難題的中堅力量。白花蛇舌草來源豐富,具有較小的正常肝細胞毒性,而對腫瘤細胞、腫瘤干細胞的細胞毒性更強,聯合使用FOD 可在盡量降低肝臟損害風險的同時,具有一定的治療作用和較高的性價比。

簡言之,肝細胞癌治療進展及耐藥很大程度源于腫瘤干細胞的異常增殖及逃逸,FOD 為殺傷LCSCS提供了可能,也為中藥提取物對腫瘤干細胞治療提供依據。