基于網絡藥理學與分子對接探討痰熱清注射液治療COPD的作用機制

郝俊峰 陳微 陳建建

摘要：目的 基于網絡藥理學方法探討痰熱清注射液治療慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructivepulmonarydisease，COPD）的潛在作用機制。方法 采用文獻檢索收集痰熱清注射液的有效化學成分，利用Pubchem及ChEMBL數據庫的收集有效成分的靶點；利用OMIM，DrugBank，Genecards，Disgenet數據庫檢索慢性阻塞性肺疾?。ㄒ韵潞喎Q慢阻肺）的相關靶點；取痰熱清注射液靶點及慢阻肺靶點的交集，得到核心靶點；將核心靶點導入String平臺進行蛋白質相互作用分析，構建PPI網絡圖并挖掘其中潛在的蛋白質功能模塊；利用Metascape對核心靶點進行GO和KEGG富集分析；使用Cytoscape軟件構建慢阻肺與信號通路的網絡圖。最后運用AutoDockVina對Degree值前十的基因及有效成分進行分子對接。結果 得到有效化學成分107個，藥物靶點1722個，COPD靶點6525個，最終獲得核心靶點1327個。痰熱清注射液治療慢阻肺主要成分為香豆素、咖啡酸、6-氨基己酸等，關鍵靶點為TP53、HSP90AA1、SRC等。結論 本研究初步揭示了痰熱清注射液多成分，多靶點，多通路治療慢阻肺得到潛在機制，為痰熱清注射液的基礎及臨床研究提供了依據。

關鍵詞：痰熱清注射液；慢性阻塞性肺疾??；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R563.3 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）04-0048-08

Study on the Mechanism of Tanreqing Injection in theTreatment of COPDBased on Network Pharmacology and Molecular Docking

HAO Jun-feng1， CHEN Wei¹， CHEN Jian-jian²

（1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330000， China;2. Jiangxi Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanchang 330000， China）

【Abstract】Objective： To study the potential mechanism of Tanreqing Injection in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） based on network pharmacology. Methods： The active chemical components of Tanreqing Injection were collected through literature retrieval， and the targets of active components were collected by using Pubchem and ChEMBL databases. The targets related to COPD were searched by OMIM， DrugBank， Genecards and Disgenet databases. The intersection of Tanreqing Injection target and COPD target was collected to obtain the core targets. The core targets were imported into the String platform for protein interaction analysis， PPI network diagram was constructed and potential protein functional modules were mined. The GO and KEGG enrichment of the core targets were analyzed by Metascape. The network diagram of COPD and signaling pathways was constructed by using Cytoscape software. Finally， AutoDockVina was used for molecular docking of genes and active components with the top 10 degrees. Results： 107 effective chemical components， 1722 drug targets， 6525 COPD targets and 1327 core targets were obtained. The main components of Tanreqing Injection in the treatment of COPD were coumarin， caffeic acid， 6-aminocaproic acid， etc. and the key targets were TP53， HSP90AA1， SRC， etc. Conclusion： This study preliminarily reveals the potential mechanism of Tanreqing Injection in the treatment of COPD by multi-component， multi-target and multi-pathway， which provided a basis for the basic and clinical research of Tanreqing Injection.

【Key words】Tanreqing Injection; Chronic Obstructive Pulmonary Disease; Network Pharmacology; Molecular Docking

COPD是一種臨床表現為持續性氣流受限，病理表現為氣道和（或）肺泡異常的最常見的慢性氣道疾病。COPD是全球發病率、死亡率和醫療保健負擔的主要原因，新型冠狀病毒流行更是影響了COPD患者，他們不僅比健康人更容易出現嚴重疾病表現，而且還受到醫療保健服務中斷和社會孤立的負面影響^［1］。世界衛生組織指出，到2030年，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）可能成為第三大死亡原因^［2］。因此，慢阻肺是一個大眾人類生命健康，影響社會發展的疾病。傳統中醫藥因其治療手段多樣，藥物靶點多樣，耐藥性低等在治療慢阻肺中有光明前景。

痰熱清注射液由王永炎院士組方、曹春林教授工藝開發，歷經數年艱苦研制于2003年成功上市。作為一款清熱解毒的中藥復方注射液，痰熱清注射液是由金銀花、黃芩、連翹、山羊角、熊膽粉等清熱解毒藥組方而成，具有清熱解毒，化痰的功效，并已被廣泛應用于COPD的臨床治療。對5種清熱注射液治療AECOPD的系統性評價中也發現痰熱清注射液是治療AECOPD患者最有效的療法^［3］。本研究運用網絡藥理學及生物學信息技術方法研究痰熱清有效成分的潛在作用靶點，以探討其治療慢阻肺的作用機制，以期為今后的基礎及臨床研究提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 痰熱清注射液中活性成分的篩選和靶點預測 我們通過中國知網（CNKI）、萬方數據庫、維普數據庫，進行痰熱清注射液化學成分相關文獻檢索。將各文獻中的化學成分進行合并整理，得出目前已知的痰熱清注射液的化學成分。經Python軟件的Rdkit包，計算各化學成分的QED值^［4］，我們選取QED值>0.18的化學成分作為本次研究的活性成分。將活性成分導入Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ChEMBL數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）查閱活性成分靶點，經合并整理得出痰熱清注射液的藥物靶點。

1.2 構建痰熱清注射液活性成分-靶點網絡 使用Cytoscape3.9.1軟件對已獲取的靶點預測信息進行網絡構建，并使用NetworkAnalyzer分析工具對結果進行分析得出相關評價指標：連接度（degree），以研究該網絡的互相作用關系并對結果進行可視化。

1.3 慢阻肺相關靶點檢索 以“chronicobstructivepulmonarydisease”，“COPD”為關鍵詞，在Genecards（http：//www.genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/），Disgenet（https：//www.disgenet.org/）等疾病基因數據庫中進行篩選，在剔除重復值后最終得到與慢阻肺相關靶點基因。

1.4 痰熱清注射液成分-慢阻肺靶點PPI網絡構建 為明確補元湯與慢阻肺之間相互作用的關系，利用R語言對二者相互交叉的靶點進行可視化。將獲取的交叉靶點提交至String（https：//www.string-db.org/）平臺上構建蛋白質互作（PPI）網絡，將物種選擇為“Humosapiens”，最小互作用閾值調整至“highestconfidence”，其余選項均為默認，得到PPI網絡圖。將所得PPI網絡圖導入進Cytoscape3.9.1運用MCODE插件對PPI網絡進行進一步分析，得到潛質蛋白質功能模塊，并對其進行生物學描述。

1.5 痰熱清注射液-慢阻肺靶點功能與通路富集分析 運用Matescape平臺（http：//metascape.org/gp/index.html）對痰熱清注射液與慢阻肺交叉靶點進行GOBP，GOMF，GOCC，KEGG富集分析，并對結果進行可視化。

1.6 分子對接 選取Degree值前10的活性成分及靶點，運用AutodockVina進行分子對接模擬。靶點基因蛋白晶體選取RCSB數據庫（https：//www.pdbus.org/）中已實驗驗證且評分第一位的蛋白晶體結構，活性成分的3D結構取自PubChem數據庫。應用PyMOL對結合能末4位的分子對接模型進行可視化。

2 結果

2.1 痰熱清注射液活性成分靶點的收集 根據王亮等人的總結^［5］得出痰熱清注射液包含107種化學成分，QED值>0.18的有81種，QED值排名前10位（見表1）。PubChem及ChEMBL中有靶點記錄的活性成分有57個，活性成分靶點共1721個。

2.2 痰熱清注射液活性成分-靶點網絡 將上步所得結果導入Cytoscape3.9.1軟件構建痰熱清注射液活性成分-靶點網絡圖（見圖1）

2.3 慢阻肺相關靶點的收集 查詢Genecards，OMIM，Disgenet疾病基因數據庫，剔除重復值最終納入6524個與慢阻肺相關的靶點基因。

2.4 痰熱清注射液活性成分-慢阻肺靶點PPI網絡構建 將篩選過后的痰熱清注射液活性成分與慢阻肺相關靶點基因取交集，到補元湯活性成分-慢阻肺共有靶點1721個。

將所得1721個靶點提交至String平臺，經Cytoscape3.9.1軟件得出PPI網絡圖（圖2）。在復雜的PPI網絡圖中存在部分密度高的區域稱為module，其功能在整個網絡系統中發揮重要作用，故有必要進一步導入Cytoscape3.9.1軟件對其進行深入分析。經過內置MCODE插件的算法分析，得到module。選取其中2個最佳評分的生物學進程對其進行可視化（圖2）。

2.5 痰熱清注射液成分-慢阻肺靶點功能與通路富集分析 應用Matescape數據平臺對痰熱清注射液活性成分-慢阻肺共有靶點進行信號通路分析，包括GO的BP圖（biologicalprocess）、MF（molecularfunction）、CC（cellularcomponent）以及KEGG通路，并選取LogP絕對值排名后10名結果，借助R語言對結果進行可視化（圖3）。

2.6 分子對接結果 應用分子對接工具AutodockVina軟件對Degree值排名前10的活性成分及靶點基因蛋白進行分子對接。結合能越低表示分子與蛋白結合活性越高，分子對接結果顯示結合能均≤-3.8 kJ·mol^-1，表示核心成分具有較好的活性。此外我們還發現熊去氧膽酸（31401）、膽酸（221493）、黃芩素（5281605）、鵝去氧膽酸（10133）與各核心靶點結合能均≤-6.4 kJ·mol^-1，提示他們與靶點蛋白結合時具有更高的活性。分子對接結合能結果見表2。并應用PyMOL對結合能較低的前4位進行可視化（圖4）。

3 討論

本研究從痰熱清注射液的107種有效性成分中，根據QED值、PubChem及ChEMBL數據庫篩選出57種有靶點記錄的活性成分，活性成分靶點共1721個。通過痰熱清注射液活性成分-靶點網絡圖，選取Degree值前10位為痰熱清注射液的核心成分，依次為香豆素、咖啡酸、6-氨基己酸、苯甲酸、熊去氧膽酸、膽酸、黃芩素、鄰苯二甲酸二丁酯、肌醇、鵝去氧膽酸。香豆素具有廣泛的抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用^［6］；咖啡酸已被廣泛用作對抗微生物發病機制和由細菌、真菌和病毒等微生物引起的慢性感染的替代方案^［7］；6-氨基己酸是一種具有疏水性、柔性結構的ω-氨基酸，臨床上常作為抗纖維蛋白溶解劑^［8］。近來研究發現過量的纖溶酶生成經常促成急性和慢性炎癥過程^［9］；苯甲酸具有抗微生物作用^［10］；熊去氧膽酸是腸道細菌轉化脫氧膽酸后產生的次級膽汁酸，是腸道屏障完整性的關鍵調節劑，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和細胞保護活性^［11］；膽汁酸、鵝去氧膽酸不僅是消化表面活性劑，也是重要的細胞信號分子，可刺激多種信號通路來調節一些重要的生物過程，調節炎癥反應、屏障功能和調節腸道菌群方面發揮著關鍵作用^［12-13］；黃芩素是一種生物活性類黃酮，具有抗炎和抗癌活性^［14］，抗氧化和抗炎活性主要是由于它們具有清除活性氧（ROS）和通過減弱NF-κB的活性^［15］和抑制包括單核細胞趨化蛋白在內的幾種炎性細胞因子和趨化因子的表達來改善抗氧化狀態的能力^［16］；肌醇不僅是膜結合磷脂酰肌醇的重要成分，而且以其游離形式及其異構體或其磷酸鹽衍生物參與多種細胞過程，包括離子通道通透性、代謝穩態、mRNA輸出和翻譯，細胞骨架重塑，應激反應。鄰苯二甲酸二丁酯具有生殖毒性，提示我們應監測痰熱清注射液遠期可能存在的不良反應。

將藥物靶點與COPD的靶點取交集，得出核心靶點。根據PPI網絡圖，我們根據Degree值高低篩選出10個核心靶點，依次是TP53、HSP90AA1、SRC、MAPK3、STAT3、MAPK1、ESR1、HDAC1、AKT1、CTNNB1。眾所周知，COPD是慢性氣道炎癥性疾病，炎癥和氧化應激是伴隨、促進甚至引發多種癌癥的的病理過程。具體而言JAK/STAT3^［17］信號傳導、CTNNB1突變引起的癌癥的經典通路WNT/β-連環蛋白^［18］，臨床上也發現COPD與肺癌高度相關。肺癌特別是小細胞肺癌（SCLC）幾乎總是包括腫瘤抑制基因TP53^［19］的功能失活，STAT3^［20］在腫瘤生態系統中的癌癥和非癌細胞中都被廣泛過度激活，ESR1所調控雌激素受體（Estrogenreceptor）^［21］也被視為肺癌的發生機制。SRC蛋白激酶抑制劑^［22］正積極開展肺癌在內的多種實體瘤的臨床試驗。HDAC抑制劑（HDACi）具有多效性細胞作用并誘導促凋亡基因/蛋白質的表達，治療在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系中顯示出抗增殖活性。在免疫應答中，Akt信號通路成分通過控制炎性細胞因子、miRNA和包括吞噬作用、自噬和細胞代謝的功能，在巨噬細胞生物學和炎癥性疾病調節中具有獨特的亞型特異性作用。HSP90AA1調控熱休克蛋白^［23］（Heatshockprotein）的產生，熱休克蛋白能抑制肺部炎癥。MAPK1^［24］及MAPK3^［25］調節TNF-α產生、NADPH氧化酶激活、中性粒細胞遷移和DNA損傷誘導的細胞周期停滯中的分子機制的知識，這些機制涉及COPD在內的肺部炎癥。

GO富集分析發現，痰熱清注射液能影響細胞的突觸及樹突傳導，蛋白結構域特異結合，轉錄因子結合，以及細胞對氮化合物的反應，激素反應來起到治療COPD的作用。KEGG富集通路包括癌癥通路（Pathwaysincancer）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactiveligand-receptorinteraction）。

本研究通過網絡藥理學及分子對接的方法初步發現痰熱清注射液治療COPD的活性成分、靶點及通路。痰熱清注射液通過抑菌、調節免疫來降低炎癥反應，并可能具有預防COPD轉化為肺癌的可能。本研究還需實驗進一步驗證，以期為基礎實驗提供參考。

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（收稿日期：2022-11-21）