免疫層析試紙條在食品安全檢測中的應用

舒友琴,魏 榮

(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院,河南 鄭州 450046)

免疫層析試紙條檢測技術融合免疫技術和層析技術于一體,具備層析技術的優越分離能力和抗原-抗體免疫反應的高特異性,具有檢測快速、制作簡單、成本低等優點,目前,該法已廣泛應用于食品安全檢測領域。在應用初期,免疫層析試紙條技術只能檢測單一的目標物,且檢測靈敏度較低。經過不斷探索,已開發出具備多重檢測能力和以新型納米標記物為探針的試紙條,免疫層析檢測技術變得極為靈敏高效。

1 免疫層析試紙條的原理

常規的免疫層析試紙條由樣品墊、結合墊、吸水墊及硝酸纖維素膜等四個基本部分組成,試紙條將這四個部分相互重疊粘貼于聚氯乙烯底板上(圖1),其中硝酸纖維素膜上固化兩條線即檢測線(T線)和質控線(C線)。免疫層析試紙條檢測技術分為競爭法和夾心法[1]。

圖1 試紙條結構示意圖

1.1 競爭免疫層析法

競爭免疫層析法主要用于檢測抗原位點較少或僅具有單個抗原位點的小分子化合物。此種方法是在結合墊上噴灑含有標記物的抗體,T線處包被捕獲抗原,C線處包被二抗。檢測時在樣品墊上滴入待測樣品,如果待測樣品含有目標抗原,那么目標抗原會在毛細作用力下沿著層析方向先與結合墊上的標記抗體結合,形成免疫復合物,不會再與T線處的捕獲抗原結合,T線就無色,而未與捕獲抗原結合的標記抗體會與二抗結合使C線顯色,此時檢測結果為陽性。相反,如果不含有目標抗原,則標記抗體會與T線和C線處的包被物質結合,此時T線和C線均顯色,檢測結果為陰性。若C線不顯色,則說明試紙條失效。

1.2 夾心免疫層析法

1.2.1 雙抗體夾心免疫層析法

雙抗體夾心免疫層析法用于檢測含有多個結合位點的大分子抗原。此種方法是在結合墊上噴灑被標記物標記的抗體,T線固定與目標抗原和另一抗原表位結合捕獲抗原,C線處包被二抗。檢測時,如果樣品中含有目標抗原,那么目標抗原會在層析作用下先與標記抗體結合形成復合物,之后又與捕獲抗體結合形成雙抗體夾心結構,從而T線顯色。未能與捕獲抗原結合的標記抗體會被C線抗體攔截并結合顯色,此時樣品檢測結果為陽性。如果樣品中不含有目標抗原,則只有C線顯色,樣品檢測結果為陰性。若C線不顯色,說明試紙條失效。

1.2.2 雙抗原夾心免疫層析法

雙抗原夾心免疫層析法用于檢測含有多個結合位點的大分子抗體,與雙抗體夾心免疫層析法類似,此種方法是在結合墊上噴灑標記抗原,T線固定二抗作為捕獲抗體,C線固定識別抗原的特異性單抗或多抗。結合墊中的標記抗原首先與樣品中的目標抗體結合形成復合物,流動到T線時,復合物會與捕獲抗原結合顯色。未結合的標記抗原會被C線攔截并聚集顯色。陽性樣品的檢測結果為T線和C線同時顯色,而陰性樣品的檢測結果只有C線顯色。

2 免疫層析試紙條的標記探針

傳統試紙條采用膠體金標記技術,判讀簡單,但不能夠滿足對更高檢測靈敏度的需求?？蒲泄ぷ髡唛_發了更多基于標記探針的免疫層析試紙條,標記探針變得多樣化。表1是對試紙條標記探針的簡單介紹[2-8]。

表1 免疫層析試紙條的標記探針

3 免疫層析試紙條檢測技術在食品安全檢測中的應用

3.1 農藥殘留檢測

目前,我國殘留比較嚴重的農藥主要是氨基甲酸酯類農藥和有機磷農藥。朱亮亮等[9]研發膠體金免疫層析試紙條,檢測蔬菜和水果中的有機磷農藥,對辛硫磷、對硫磷、丙溴磷和氯唑磷等有機磷農藥的檢測限均為200 μg/kg,檢測時間僅為15 min,對大批量樣本檢測具有實際意義。呂俊海等[10]建立了一種基于熒光微球免疫層析的檢測試紙卡,實現了對農藥醚菊酯的定量檢測,檢測限為1.057 ng/mL,定量限為1.890 ng/mL。

3.2 獸藥殘留檢測

畜產品中殘留的獸藥種類主要是激素類、抗生素類和抗菌類。激素類藥物具有引起人體內分泌紊亂和性早熟等危害,主要的激素類藥物有克倫特羅(俗名“瘦肉精”)、雌二醇和雌三醇等。試紙條技術在激素類藥物殘留檢測中的應用如表2所示。

表2 免疫層析試紙條在激素類獸藥殘留檢測中的應用

β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類等是畜產品中殘留的主要抗生素種類。免疫層析試紙條在這些抗生素類獸藥檢測的應用如表3所示。

表3 免疫層析試紙條在抗生素類獸藥殘留檢測中的應用

抗菌類獸藥殘留主要是孔雀石綠和硝基呋喃類藥物。孫虹等[21]開發了一種在超順磁性納米微球上偶聯孔雀石綠單克隆抗體探針的免疫層析試紙條,定性靈敏度為1 μg/mL,定量靈敏度為0.60 ng/mL,對無色孔雀石綠無交叉反應,可適用于現場快速檢測魚肉或水體中的孔雀石綠。

免疫層析試紙條可用于飼料樣本中硝基呋喃類藥物的快速檢測和現場篩查,在檢測硝基呋喃類藥物中的應用如表4所示。

表4 免疫層析試紙條在硝基呋喃類獸藥殘留檢測中的應用

3.3 重金屬檢測

重工業的發展導致了“三廢”污染,人體攝入受到重金屬污染的食品后,重金屬會在人體內蓄積,危害人體健康,如鉛超標會誘發貧血且損傷神經系統,汞超標會導致嚴重肝腎損傷,還會導致血尿,孕婦體內砷超標有可能導致胎兒畸形。目前,免疫層析試紙條在重金屬檢測中的應用如表5所示。

表5 免疫層析試紙條在重金屬檢測中的應用

3.4 食品添加劑檢測

合理使用食品添加劑可改善食品品質,但濫用食品添加劑會危害人體健康。比較常用的食品添加劑有增味劑谷氨酸鈉、肉類發色劑亞硝酸鹽、漂白劑二氧化硫、防腐劑苯甲酸鈉等。劉鳳銀等[27]開發了用于快速檢測食品中亞硝酸鹽含量的免疫層析試紙條,檢測限為1 mg/kg,檢測范圍為1-70 mg/kg,該免疫層析試紙條可用于肉制品、蔬菜制品中亞硝酸鹽殘留量的檢測。

3.5 違禁食品添加物質的檢測

三聚氰胺事件發生以后,國家公布了食品中可能違法添加的非食用物質名單,其中包括蘇丹紅、三聚氰胺、羅丹明B等。蘇丹紅是一種化學染色劑,不屬于食品添加劑,人在食用后會誘發癌癥。人體攝入過量三聚氰胺可能會產生結石,嬰幼兒飲用了高濃度三聚氰胺污染的奶粉后,會導致泌尿系統出現問題。羅丹明B是人工合成的化工染料,往往被非法用作辣椒粉、辣椒油等調味品的染色劑,食用后會致癌致突變。表6是試紙條技術在違禁食品添加物質檢測中的應用。

表6 免疫層析試紙條在違禁食品添加物檢測中的應用

3.6 生物毒素的檢測

生物毒素是由動物、植物和微生物等產生的有毒物質,包括貝類毒素、微囊藻毒素和真菌毒素等。真菌毒素廣泛存在于農產品類食品中,常見的與食品有關的真菌毒素有伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素和玉米赤霉毒素等。由生物毒素引起的食品安全事件時有發生,如食用黃曲霉毒素超標的食物和食用含有蘑菇毒素的野生蘑菇導致的中毒事件。目前免疫層析試紙條在生物毒素檢測方面已經取得了較大進展,如表7所示。

表7 免疫層析試紙條在生物毒素檢測方面的應用

3.7 食源性致病菌的檢測

食源性致病菌是通過食物傳播疾病的細菌。沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌等是較為常見的食源性致病菌。食用被致病菌感染的食物除了引起消化道癥狀外,還引起嚴重的并發癥。致病微生物引起的食源性疾病是我國食品安全的重大隱患,免疫層析試紙條在此類檢測中的相關應用如表8所示。

表8 免疫層析試紙條在食源性致病菌檢測方面的應用

3.8 人畜共患病的檢測

布魯氏菌病、口蹄疫、結核病等是常見的人畜共患病。生物素和地高辛被用作核酸探針,具有敏感和特異性的特點,龔真莉等[40]將其用于引物中,使擴增產物與探針結合,從而建立了一種基于核酸探針的試紙條,用于檢測口蹄疫病毒,所建立的核酸試紙條可以檢測到0.3×10-3-3×10-3μg/μL的RT-PCR產物,為口蹄疫病毒檢測提供了一種新的方法。郭建等[41]研制了快速檢測血清抗體的免疫層析試紙條,用于檢測動物的布魯菌病和結核病,特異性好,準確率高,檢測結果與現有的檢測方法高度符合。

免疫層析試紙條檢測快速、即時,已經朝著高靈敏度和定量化方向發展。與傳統技術相比,基于標記探針的試紙條技術具有更加優良的性能,能夠快速實現多靶標同時檢測?？梢灶A見,隨著數字技術、智能技術的迅猛發展,更加便捷的智能化試紙條會更加廣泛地用于食品安全檢測領域,免疫層析試紙條技術應用前景巨大。