氟中毒對肉雞促紅細胞生成素和紅細胞膜ATP酶的影響

劉玲玲,李德印,李先芳,沈永恕,張 磊

(河南牧業經濟學院 動物醫藥學院,河南 鄭州 450046)

氟是動物機體必需的微量元素之一,在自然環境中廣泛存在,具有蓄積毒性,對動物的危害主要表現在其對機體的多器官、多系統性損傷等,能造成多種機能和形態的異常改變[1,2]。近年來,人畜氟中毒的報道日益增多,氟污染已經嚴重威脅到當地畜禽和人類的健康[3]。大量研究表明,氟中毒會引起機體發生貧血[4,5],能夠顯著降低肉仔雞血細胞數、血清溶菌酶和補體C3、C4含量[6]。促紅細胞生成素(EPO)作為調控紅細胞生成的重要糖蛋白激素,在抵抗外界因素對動物機體紅細胞的損傷過程中發揮著重要作用[7,8],目前有關氟中毒對肉雞EPO含量的影響尚未見報道,本試驗通過構建肉雞氟中毒模型,觀察氟中毒對肉雞的血液學相關指標的影響,探討氟中毒對肉雞紅細胞的毒性以及EPO在其致肉雞貧血中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與主要試劑

1日齡健康薩索肉雞購自鄭州雪霞農業科技有限公司;分析純氟化鈉(NaF)購自于Sigma公司;煌焦油藍染液、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒、Na+-K+-ATPase試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所;EPO檢測試劑盒購自于美國ADL公司;全自動血細胞分析儀購自深圳邁瑞醫療器械有限公司。

1.2 試驗方案

選取240只1日齡健康薩索肉雞,試驗方法參考黃俊祥等[6]方法進行,隨機分為4組,每組60只。對照組飼喂基礎日糧(F,11 mg/kg,以實際氟含量計,下同),試驗組分別在基礎日糧中添加不同劑量的NaF:高氟1組(F,300 mg/kg)、高氟2組(F,600 mg/kg)、高氟3組(F,900 mg/kg),常規雛雞飼養管理,自由采食與飲水,分別于試驗第14天、28天和42天進行心臟采血用于檢測。

1.3 指標測定

1.3.1 血液學指標檢測

采用全自動血細胞分析儀測定血液中血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)和平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)等指標。

1.3.2 網織紅細胞數目檢測

心臟采血后,取一滴全血加入含有煌焦油藍染液的玻片上,混勻,室溫靜置5～10 min。取適量的混勻液制備血涂片,置于油鏡下觀察。選取紅細胞分布均勻且染色質量較好的部分進行計數,統計每1000個紅細胞中網織紅細胞的數目。

1.3.3 紅細胞膜的ATP酶活性檢測

采用無機磷比色法進行紅細胞膜的ATP酶活性檢測。按照試劑盒說明書進行操作,分別檢測紅細胞膜的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

1.3.4 紅細胞滲透脆性的檢測

采用濃度梯度法測定紅細胞對不同濃度的低滲氯化鈉溶血的抵抗力,即紅細胞滲透脆性。取30 μL肝素抗凝血,分別加入到不同濃度(0.65%、0.60%、0.55%、0.50%、0.45%、0.40%、0.35%、0.30%、0.25%)的低滲氯化鈉溶液試管中,室溫靜置2 h后,于分光光度計510 nm波長處比色,與完全溶血管進行比較,計算溶血度。溶血的判定標準如表1所示。

表1 紅細胞滲透脆性試驗溶血的判定標準

1.3.5 促紅細胞生成素(EPO)含量的檢測

分離血清后,參考EPO檢測試劑盒說明書進行操作,將酶標儀的波長設置為450 nm,該條件下測定標準品和樣品的吸光度(OD)值,標準品濃度及OD值繪制標準曲線,計算出樣品中EPO的含量。

1.4 數據統計與分析

試驗數據以平均值±標準差表示,采用SPSS 22.0統計學軟件One way-ANOVA分析比較各組數據間的差異顯著性,并用LSD法進行多重比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 氟中毒后血液學指標的變化

如表2所示,與對照組相比,試驗第14天時高氟1組Hb升高,無顯著差異(P>0.05),HCT、MCV和MCHC降低,無顯著差異(P>0.05),MCH顯著降低(P<0.05);高氟2組HCT和MCHC顯著降低(P<0.05),MCV無顯著差異(P>0.05),Hb和MCH極顯著降低(P<0.01)。試驗第28天和42天,除高氟2組在28天時MCV與對照組相比,無顯著降低(P>0.05)外,高氟1組和高氟2組其余血液學指標與對照組相比顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01);試驗期間,試驗組血液學指標與對照組相比極顯著降低(P<0.01)。

表2 氟中毒后血液學指標的變化

2.2 氟中毒后血液中網織紅細胞的變化

如表3所示,與對照組相比,試驗第14天時高氟1組血液網織紅細胞數顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組血液網織紅細胞數降低,差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01);試驗第28天和42天,各試驗組血液網織紅細胞數與對照組相比顯著或極顯著降低(P<0.01)。

表3 氟中毒后血液中網織紅細胞的變化 %

2.3 氟中毒后紅細胞膜ATP酶活性的變化

如表4所示,整個試驗期間,與對照組相比,高氟1組紅細胞膜Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細胞膜Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.01)。

表4 氟中毒后紅細胞膜ATP酶活性的變化 U/mL

試驗第14天,與對照組相比,高氟1組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低,無顯著差異(P>0.05),高氟2組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟3組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.01)。試驗第28天,高氟1組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.01);試驗第42天,各試驗組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05)。

2.4 氟中毒后紅細胞滲透脆性的變化

如表5所示,與對照組相比,試驗第14天,高氟1組紅細胞滲透脆性無顯著升高(P>0.05),高氟2組紅細胞滲透脆性顯著升高(P<0.05),高氟3組紅細胞滲透脆性顯著升高(P<0.01)。試驗第28天,與對照組相比,高氟1組紅細胞滲透脆性顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細胞滲透脆性顯著升高(P<0.01);試驗第42天,各試驗組紅細胞滲透脆性與對照組相比顯著升高(P<0.01)。

表5 氟中毒后紅細胞滲透脆性的變化 g/L

2.5 氟中毒后促紅細胞生成素(EPO)含量的變化

如表6所示,試驗第14天,與對照組相比,高氟1組血清EPO含量顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組血清EPO含量顯著降低(P<0.05或P<0.01);試驗第28天和42天,各試驗組血清EPO含量顯著降低(P<0.01)。

表6 氟中毒后促紅細胞生成素(EPO)含量的變化 mIU/mL

3 討論

研究證實,氟在體內的蓄積是引起機體代謝性貧血的原因之一[9,10]。本試驗結果顯示,氟中毒導致Hb含量顯著降低,結合王美玲等[11]報道的氟中毒會導致肉雞血液紅細胞數目的降低,表明氟中毒會引起肉雞發生貧血。高氟1組在染毒后第14天時,引起肉雞血液紅細胞數目和網織紅細胞數目的上升,推測可能是由于過量氟的攝入,導致機體動員其它血液儲備器官釋放紅細胞,同時骨髓新生成的網織紅細胞數會暫時升高。隨著染毒劑量的加大及持續時間延長,毒性作用超過了機體自身代償能力,導致機體紅細胞數、血紅蛋白含量以及網織紅細胞數目會表現明顯降低,直接影響到機體的造血功能。

本研究數據表明,肉雞氟中毒降低了紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性,增加了紅細胞的滲透脆性,與多項研究結果一致[12-14]。細胞膜ATP酶活性受到抑制,一方面改變細胞膜的抗氧化酶系統,引起機體細胞的ATP活力明顯下降;另一方面會導致細胞內外離子與水分的調控失衡、膜電位的改變,最終紅細胞膜脆性明顯增大,加劇肉雞貧血的發生[15,16],這與本試驗中Hb及滲透脆性的變化結果相一致。

EPO是一種由腎臟產生的調控紅細胞生成的糖蛋白激素,它能夠刺激并加快肉雞各發育階段的幼紅細胞分裂,促進紅細胞成熟。另外,EPO還具有抗氧化,穩定紅細胞膜的功能等作用[17]。氟中毒嚴重損傷了動物機體的腎臟功能,從而影響了EPO的生成[18-20]。本試驗中高氟1組隨著染毒時間的延長,肉雞血清EPO含量先略微增加后又降低,而高氟2組和3組血清EPO含量顯著降低,說明肉雞血清EPO含量與染毒的劑量和中毒時間有密切關系,且氟在動物機體內有較強的蓄積毒性。此外,EPO能夠平衡細胞膜內外的正常滲透壓,血清中EPO減少會導致機體的紅細胞膜流動性降低,完整性被破壞,從而影響紅細胞的生成,加重肉雞的溶血性貧血癥狀。