鯉皰疹病毒2型ORF144原核表達和多克隆抗體制備

吳紅軍，潘李佳，李 節，何艷格，杜宏瑤，龔保榮，吳宜靖，鮑傳和，朱若林

鯉皰疹病毒2型ORF144原核表達和多克隆抗體制備

吳紅軍，潘李佳，李 節，何艷格，杜宏瑤，龔保榮，吳宜靖，鮑傳和，朱若林*

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)引起的鯽造血器官壞死病是近年來對鯽()養殖業危害最大的疾病之一。通過PCR擴增得到ORF144基因全長，將其與pET-32a原核表達載體連接構建重組載體pET-ORF144，轉化到大腸桿菌中，經IPTG誘導表達得到大小約 46 kDa的重組蛋白，該蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在。將重組融合蛋白純化后免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體，間接ELISA檢測顯示抗體效價大于1∶51 200。經Western Blot驗證該抗體可特異性識別感染CyHV-2的細胞中的蛋白質和純化的融合蛋白。間接免疫熒光結果顯示該蛋白定位于細胞質，呈點狀分布。結果表明構建的ORF144多克隆抗體可為病毒的基因功能和致病機制研究提供基礎。

鯉皰疹病毒2型；ORF144；原核表達；多克隆抗體

CyHV-2是一種能感染鯽（）和金魚（Linnaeus），導致急性鰓出血并引起高死亡率的病毒病原。該病毒自 1992 年首次在日本發現后[1]，迅速在全世界傳播，在美國[2]、英國[3]、中國[4]、新西蘭[3]和澳大利亞[5]都有發現。在我國江蘇省，僅 2012 年就導致鯽發病面積達 3萬hm2，危害 90% 以上養殖區，發病區死亡率 50% 以上，造成嚴重的經濟損失[6]。此后在湖南、江西、浙江、湖北等省[7]也相繼檢測到感染CyHV-2的鯽魚。

CyHV-2屬于異皰疹病毒科（）、鯉皰疹病毒屬（）。該屬還包括鯉皰疹病毒1型（Cyprinid herpesvirus1，CyHV-1）、鯉皰疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus3, CyHV-3）和鰻鱺皰疹病毒1型（Anguillid herpesvirus1，AngHV）[8]。該病毒為雙鏈DNA病毒，基因全長約 290 kb，共包含 156 個開放閱讀框（Open reading frame, ORF）[9]。研究表明，在CyHV-2的基因組中有一組TRIM（Tripartite-motif protein）家族基因，包含4個ORF（ORF41、128、144和150）[10]。TRIM家族蛋白屬于E3泛素化連接酶，其在哺乳動物和脊椎動物中的功能已開展相關研究，但是其在病毒中的功能還研究較少。

有研究表明，哺乳動物和魚類中的TRIM家族蛋白在細胞的增殖與分化[11]、腫瘤的抑制[12]等方面發揮著調控作用。此外，TRIM在病毒與宿主的互作中，能通過影響宿主的先天性免疫發揮著對病毒的抑制作用[13]，但是，對病毒基因組中的TRIM蛋白類似物的作用研究較少。

本試驗選取CyHV-2基因組中TRIM家族的ORF144基因開展研究。通過構建原核表達載體獲得重組融合蛋白，將蛋白免疫小鼠獲得了其多克隆抗體并檢測了抗體的效價和特異性，以期為CyHV-2病毒的基因功能和發病機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

CyHV-2為實驗室從患病鯽中分離得到。鯽鰓細胞系（cells, CCG）由本實驗室構建。BALB/c小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心。pET-32a質粒、DH5α和Rosetta （DE3）感受態、病毒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶等均購自北京全式金生物技術有限公司，DNA純化回收試劑盒及PAGE膠蛋白微量回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和商品化抗體均購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank（MN201961）上發表的序列，利用Primer6.0軟件設計1對特異性引物擴增全長，序列為F: 5'-TTTGATGTCCACCTACG-3'；R: 5'-AGTCTTAGAGTATGCTGC-3'，劃線處分別是I和I酶切位點，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 ORF144基因的克隆

以純化的CyHV-2病毒DNA為模板，用合成的特異性引物進行PCR擴增，PCR反應體系為：DNA模板 2 μL，10 μmol·L-1上下游引物各 2 μL，Prime star Max Premix （2×）25 μL，滅菌雙蒸水19 μL，總體系為 50 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環；72 ℃延伸 10 min。將PCR產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的片段并與pEasy-T1載體連接，連接產物轉化到DH5α感受態中，PCR篩選陽性克?。麨閜Easy-T-ORF144）后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.4 重組原核表達載體的構建

將重組質粒pEasy-T-ORF144和pET-32a（+）載體分別用I和I在 37 ℃進行雙酶切，2 h后，酶切產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段，用T4 DNA 連接酶 4℃連接過夜，轉化至Rosetta（DE3）感受態細胞中，PCR篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序無突變后用于誘導原核表達，重組質粒命名為pET-ORF144。

1.5 融合蛋白的誘導表達

將包含pET-ORF144質粒的大腸桿菌Rosetta接種于含氨芐抗生素的LB培養基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養菌液，待OD600值達到 0.6 時加入終濃度為 0.5 mmol·L-1的IPTG進行誘導表達，6 h后離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，加入蛋白質上樣緩沖液后，沸水浴 10 min，8 000 r·min-1離心后各取 10 μL上清進行SDS-PAGE電泳。將誘導得到的目的蛋白切膠并通過PAGE膠蛋白微量回收試劑盒進行回收純化。

1.6 多克隆抗體的制備

取純化后的融合蛋白免疫 6 周齡BALB/c小鼠，首次免疫將融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻，以后每隔 7 d將融合蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合加強免疫，共免疫 4 次。首次免疫劑量為每只 50 μg，加強免疫劑量為每只 30 μg，最后一次加強免疫3 d后取血，分離血清獲得抗體。

1.7 間接ELISA測定抗體效價

將純化的融合蛋白用碳酸鹽包被液稀釋到 1.25 μg·mL-1包被酶標板，100 μL·孔-1，37 ℃孵育 2 h，TBST清洗 3 次。將待測血清作為一抗進行 2 倍梯度稀釋，從1∶ 24×100依次稀釋到1∶212×100，37 ℃孵育 1 h，TBST清洗 3 次。以HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育 2 h，TBST清洗 3 次。經四甲基苯胺（TMB）溶液顯色后用酶標儀測定OD450值，以檢測孔OD450值是陰性對照OD4502 倍以上來確定抗體效價。同時設置未免疫小鼠血清為陰性對照，PBS緩沖液為空白對照，每個稀釋度重復3次，結果取平均值。

1.8 Western Blot檢測

分別取CyHV-2感染的CCG細胞樣品、純化后的ORF144融合蛋白和正常CCG細胞樣品，經SDS-PAGE凝膠電泳后轉到PVDF膜上（300 mA恒流轉膜 60 min）。PVDF膜經TBST洗1次后，用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，然后用TBST洗膜 2 次，每次 5 min。將抗體血清經1∶1 000稀釋后作為一抗，在 4 ℃水平搖床孵育過夜。次日，用TBST清洗 4 次，每次 5 min，加入HRP標記的羊抗鼠IgG經1∶1 000稀釋后作為二抗，室溫下孵育 2 h后，用TBST清洗 4 次，每次 5 min，最后用DAB顯色液進行顯色。

1.9 間接免疫熒光檢測

將CCG進行細胞傳代于 6 孔板中的無菌玻片上，第2天接種CyHV-2病毒，48 h觀察到細胞出現典型病變后，取細胞進行間接免疫熒光檢測。程序為：將玻片用PBS緩沖液清洗 3 次，每次 5 min，經 4% 多聚甲醛室溫固定 10 min及 0.3% Triton X-100透化 15 min，PBS洗凈后，加 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，PBS清洗后加入ORF144抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBS清洗 3 次后加入FITC標記的二抗（1∶150稀釋），PBS清洗 3 次后，加入DAPI室溫染色 10 min，PBS清洗 5 次，每次 5 min，50% 甘油封片后使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 ORF144基因的擴增及原核表達載體的構建

根據設計的引物PCR擴增獲得ORF144基因的全長為 702 bp（圖1），將片段切膠回收連接到pEasy-T1載體中，獲得重組載體pEasy-T-ORF144。將pEasy-T-ORF144與 pET-32a(+)連接后獲得重組載體pET-32a-ORF144。將重組質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，經比對序列無突變。

M：Marker 2000；1. PCR擴增圖；2. 陰性對照。

Figure 1 Electrophoretic profile of PCR product of ORF144 gene

M. 蛋白分子量標準；1. 未誘導；2. 誘導；3. 誘導上清；4. 誘導沉淀；5. 純化的ORF144融合蛋白。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products

2.2 目的蛋白ORF144的誘導表達

將包含重組質粒的大腸桿菌進行IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳結果顯示在約 46 kDa的位置出現了大量表達的蛋白，見圖2（a），蛋白大小與預計一致。超聲破碎處理誘導后的菌體,將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示，融合蛋白主要存在于沉淀中，以不溶性的包涵體形式存在，見圖2（b）。將目的蛋白進行切膠回收，電泳結果顯示獲得了較純的ORF144融合蛋白，見圖2（c）。

2.3 ELISA檢測抗體效價

利用間接ELISA檢測制備的多克隆抗體的效價，取3次重復試驗結果的平均值，結果見表 1。取陽性血清OD450比陰性血清OD450值大于 2.0 以上的血清稀釋度為待測血清的效價，其中PBS為空白對照，其值均小于 0.1，結果顯示，待測血清效價大于1∶51 200。

2.4 Western Blot

取CyHV-2感染的CCG細胞（圖3）及純化的融合蛋白樣品進行Western Blot試驗來檢測多克隆抗體的特異性，以未感染的細胞作為陰性對照。結果顯示，CyHV-2感染的CCG細胞和重組融合蛋白中均檢測到單一蛋白條帶，未感染細胞未檢測到任何蛋白條帶。其中CyHV-2感染的CCG細胞中的蛋白大小為約 62 kDa，比預計的 25.7 kDa大；融合蛋白大小約為 46 kDa，與誘導結果大小一致（圖4）。Western Blot結果表明，本試驗制備的多克隆抗體可以特異性識別ORF144蛋白及其融合蛋白。

表1 ELISA檢測多克隆抗體效價

注:Pa表示3組待測多抗檢測結果的平均值；Nb表示3組陰性對照檢測結果的平均值。

(a) 未感染細胞；(b) 感染后出現明顯CPE細胞。

Figure 3 CyHV-2-infected CCG cells

M. 蛋白分子量標準；1. 感染CyHV-2的CCG細胞；2. 未感染CyHV-2的CCG細胞； 3. 純化后的融合蛋白。

Figure 4 Specificity of polyclonal antibody detected by Western Blot

(a) DAPI染核；(b) 間接免疫熒光檢測ORF144蛋白；(c)疊加效果。

Figure 5 Subcellular localization of ORF144 protein incells

2.5 間接免疫熒光

取CyHV-2感染 48 h后的有明顯病變的CCG細胞，通過間接免疫熒光的方法檢測ORF144蛋白定位。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結果顯示，制備的多克隆抗體可以識別CCG細胞中的ORF144蛋白，且蛋白主要定位于細胞質上，呈點狀分布（圖5）。

3 討論和結論

CyHV-2基因組共包含156個ORF，其中只有少部分基因已開展初步研究，大部分基因功能仍然未知。Guo[14]、彭俊杰[15]及Shen[16]等分別對ORF66、ORF25和ORF92進行了原核表達并制備了其單克隆抗體；周勇[17]和余琳[18]等分別對ORF4和ORF121進行了原核表達并構建了其多克隆抗體；Zhou等[19]使用酵母表達系統制備了ORF25及其截短基因的疫苗并證實了其對CyHV-2感染具有一定的免疫保護作用；金李萍等[20]通過RNA干擾技術證實ORF57的沉默能降低CyHV-2的致細胞病變力和復制率；Du等[21]對ORF104的研究表明其可以特異性激活p38信號通路并促進病毒感染。本試驗選取的ORF144屬家族基因，其在CyHV-2感染細胞過程中的功能尚鮮見報道。

TRIM屬于E3連接酶家族，因其保守的RBCC結構域而得名，也稱為RBCC家族蛋白，其從N端到C端依次是RING結構域、B-box結構域、Coiled-coil結構域，可協調靶蛋白的泛素化，以組裝信號復合物、介導蛋白水解降解、改變亞細胞定位或調節宿主的轉錄物或疫苗蛋白質組成[22-25]。目前在人類中已報道80多種不同的TRIM，在斑馬魚中則包含200多種[26]。TRIM不僅參與轉錄、細胞增殖、信號轉導、發育、自噬和免疫[27]，還是很多重要疾?。òò┌Y、傳染病、炎癥和神經異常等）的關鍵調控因子[28]。Yang等[29]研究表明，TRIM22通過泛素化NS5α來抑制人丙型肝炎病毒（HCV）的復制；Wang等[30]研究表明，石斑魚TRIM39體外表達能抑制新加坡石斑魚虹彩病毒（SGIV）和赤點石斑魚神經壞死病毒（RGNNV）的復制；Yang[31]和Yu[32]等分別從石斑魚克隆得到TRIM25與TRIM32并驗證其能提高宿主干擾素免疫反應，抑制SGIV和RGNNV的病毒復制。TRIM不僅存在于脊椎動物中，也存在于病毒中，如人單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）、狂犬病毒（RV）和卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）等，相關研究表明病毒中的基因能通過多種途徑促進病毒的感染[33-35]。對CyHV-2的基因組解析顯示其包含4個TRIM家族類似物（ORF41、128、144和150），但是其功能研究還鮮見報道。

本試驗對CyHV-2 ORF144基因進行了原核表達，并成功獲得了其多克隆抗體。經檢測，該抗體可以識別感染CyHV-2的細胞中的蛋白質和純化的融合蛋白且特異性較強。其中，病毒感染的細胞樣品中條帶大小為約 62 kDa，比預期大小 25.7 kDa大。有研究表明TRIM家族蛋白常以同源二聚體或異源二聚體的形式存在[36-37]，其中RING結構域通過組合成一個RING結構域復合體來參與不同類型的生化過程[38-39]。具有抗HIV病毒能力的TRIM5α一般通過其B-box2功能域表面的疏水氨基酸形成高級同源多聚體[40]。本研究中Western Blot檢測到細胞中的病毒蛋白大小比預計的大，可能是因為ORF144是以多聚體的形式存在。ELISA顯示獲得的抗體效價大于1∶51 200，效價較高，間接免疫熒光結果顯示抗體可特異性識別感染細胞中的病毒蛋白，且該蛋白定位于細胞質，呈點狀分布。因此，本試驗制備的多克隆抗體，可以為ORF144基因功能研究，CyHV-2的免疫學檢測、基因功能和致病機制研究奠定基礎。

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The prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Cyprinid herpesvirus 2 ORF144

WU Hongjun, PAN Lijia, LI Jie, HE Yange, DU Hongyao, GONG Baorong, WU Yijing, BAO Chuanhe, ZHU Ruolin

(School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

Haematopoietic necrosis inis one of the most damaging diseases in recent years caused by Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2). CyHV-2 belongs to the familyand the genus. The genus also includes Cyprinid herpesvirus 1 (CyHV-1), Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), and Anguillid herpesvirus1 (AngHV). This virus is a double-stranded DNA virus with a total gene length of about 290 kb and contains 156 open reading frames (ORFs). Analysis of the CyHV-2 genome revealed that it contains four TRIM family genes, a family of E3 ubiquitinylated ligases that play an important role in the host immune system, while the role of TRIM protein analogs present in the virus has less been studied. The function of ORF144, the TRIM analogue of CyHV-2, has not been reported. In this study, the full length of ORF144 gene was obtained by PCR amplification. The recombinant prokaryotic expression vector pET-ORF144, constructed by ligating ORF144 gene with pET-32a, was transformed into competentcells, and the recombinant protein of about 46 kDa in size was obtained by IPTG-induced expression, which existed mainly as an insoluble inclusion body. The recombinant fusion protein was purified and immunized to BALB/c mice to obtain polyclonal antibodies. The potency of the antibody was greater than 1∶51 200 by indirect ELISA, and the antibody was verified by Western Blot to specifically recognize the protein in CyHV-2 infected cells and the purified fusion protein. Indirect immunofluorescence results showed that the protein was localized in the cytoplasm with a punctate distribution. In conclusion, the ORF144 polyclonal antibody constructed in this experiment can lay the foundation for gene function and pathogenesis study of the virus.

Cyprinid herpesvirus 2; ORF144; prokaryotic expression; polyclonal antibodies

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.020

2023-06-27 10:55:56

S941

A

1672-352X (2023)03-0457-06

2022-05-24

安徽省高校自然科學基金(KJ2019A0164)資助。

吳紅軍，碩士研究生。E-mail：424576755@qq.com

通信作者:朱若林，博士，講師。E-mail：jollinz@163.com

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