管葉槽舌蘭新鮮及硅膠干燥根樣內生菌多樣性研究

張鎮梁　王美娜　李健　李素珍　段曉娟　喬琦

摘 要：? 管葉槽舌蘭（Holcoglossum kimballianum）是一種珍稀瀕危蘭科植物，其野生種群亟需保護。內生菌對蘭科植物的生長發育至關重要，為評估管葉槽舌蘭內生菌的多樣性、分析采樣方式對其內生菌的影響，該文采用高通量測序技術對遷地保育狀態下新鮮與硅膠干燥的管葉槽舌蘭根內生菌進行研究。結果表明：（1）新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內生菌物種組成明顯不同，管葉槽舌蘭內生真菌注釋到6門46科51屬，內生細菌注釋到15門105科178屬；干燥后管葉槽舌蘭根內生真菌注釋到6門88科116屬，內生細菌注釋到21門154科336屬。（2）遷地保育狀態的管葉槽舌蘭根樣內生菌具有豐富的多樣性，并且內生細菌群落豐富度和多樣性遠比內生真菌群落高；經硅膠干燥后，內生真菌α多樣性指數升高、β多樣性指數降低，而內生細菌的α多樣性指數降低、β多樣性指數則升高。（3）差異顯著性真菌黃蓋小脆柄菇（Psathyrella candolleana）和刺盤孢屬（Colletotrichum）的C. tofieldiae只存在于新鮮根樣中，新鮮管葉槽舌蘭差異顯著性細菌是馬賽菌屬（Massilia），干燥根樣中差異顯著性細菌類群包括拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）及慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）。（4）共發生網絡分析顯示，經干燥后管葉槽舌蘭根樣內生菌群落中占互作主導地位的優勢物種和互作模式都發生了改變。綜上認為，不同采樣處理會影響管葉槽舌蘭根內生菌的群落結構，在研究蘭科植物根樣內生菌時宜使用新鮮的根樣。該研究結果為管葉槽舌蘭野生種群保護及人工栽培提供了內生菌數據基礎，也為蘭科植物內生微生物采樣方法提供了參考。

關鍵詞： 管葉槽舌蘭， 內生真菌， 內生細菌， 新鮮， 硅膠干燥， 多樣性

中圖分類號：? Q93-33文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2023）06-0991-15

Diversity study of endophytic communities? in fresh and? silica gel-dried root samples of Holcoglossum kimballianum （Orchidaceae）

ZHANG Zhenliang1，2， WANG Meina2， LI Jian2， LI Suzhen2， DUAN Xiaojuan2， QIAO Qi1*

（ 1. Agricultural College/Peony College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， Henan， China; 2. Orchid

Conservation & Research Center of Shenzhen and the National Orchid Conservation Center of China， Shenzhen Key Laboratory

for Orchid Conservation and Utilization， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration

for Orchid Conservation and Utilization， Shenzhen 518114， Guangdong， China ）

Abstract：? Holcoglossum kimballianum is a rare and endangered orchid， and its wild populations are in urgent need of conservation. Endophytic fungi and bacteria are important to the growth and development of orchids. In order to assess the diversity of H. kimballianum endophytes and the impact of sampling methods on the endophytes， high-throughput sequencing technology was used to study the diversity of endophytes in fresh and silica gel-dried roots of H. kimballianum in ex-situ conservation. The results were as follows： （1） The species compositions of endophytic fungi and endophytic bacteria were distinctly different in fresh and silica gel-dried roots of H. kimballianum. There were total of 6 phyla 46 families 51 genera of endophytic fungi and 15 phyla 105 families 178 genera of endophytic bacteria annotated in the roots of the H. kimballianum. After silica gel-dried， the endophytic fungi of the H. kimballianum had total of 6 phyla， 88 families， 116 genera， and the endophytic bacteria had total of 21 phyla， 154 families， 336 genera. （2） Endophytes in the roots of H. kimballianum in ex-situ conservation were of richness and diversity of? endophytic bacterial community was much higher than that of endophytic fungal community. After silica gel-dried， the α diversity indices of endophytic fungi increased and the β diversity indices decreased， while the α diversity indices of endophytic bacteria decreased and the β diversity indices increased. （3） Significantly different fungi Psathyrella candolleana and Colletotrichum tofieldiae only existed in the endophytic fungal communities of fresh roots. The significantly different bacteria in roots of fresh Hocoglossum kimballianum was Marseilla， and the significantly different bacteria in the silica gel-dried roots included Beijerinckiaceae， Xanthobacteraceae and Bradyrhizobium. （4） Co-occurrence network analysis revealed that the dominant species and interaction patterns in the endophytic communities of the roots of Hocoglossum kimballianum were changed after silica gel-dried. In summary， different sampling treatments can affect the community structure of the endophytes in the roots of H. kimballianum， and it is advisable to use fresh root samples when studying the endophytes of orchids. The results provide an endophytic data basis for wild populations conservation and artificial cultivation of H. kimballianum， and also provide a reference for sampling methods of endophytic microorganisms in orchids.

Key words： Holcoglossum kimballianum， endophytic fungi， endophytic bacteria， fresh， silica gel-dried， diversity

生態系統中，植物與大量微生物相互作用，這些微生物在地下和地上植物器官的內部和外表面都有定殖（Compant et al.， 2019；Escudero et al.， 2019），這些與植物相關的微生物群落統稱為植物微生物群（Marchesi et al.， 2015）。細菌和真菌是植物微生物群的主要組成部分，它們對植物微生態系統的平衡起到重要作用。植物中的內生菌是指其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物中的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內的菌類。內生真菌對蘭科植物非常重要，蘭科菌根真菌屬于內生真菌，它們是蘭科植物生長發育各個階段不可或缺的關鍵因素，能直接參與蘭科植物根系甚至整個植株的生理代謝活動，從而保障蘭科植物的生長、個體間競爭以及對病原體的防御（蓋雪鴿等，2014；Li et al.， 2021）。高越等（2019）從手參（Gymnadenia conopsea）根系中分離出角擔菌屬（Ceratobasidium），將該菌株與手參種子進行共培養，發現它能明顯促進手參種子原球莖的形成且最終分化成幼苗。楊文科（2020）通過遷地共生萌發從白旗兜蘭（Paphiopedilum spicerianum）原球莖中分離出膠膜菌屬（Tulasnella），它能有效促進其種子萌發直到幼苗階段。這都表明內生真菌在蘭科植物的生長發育中具有極大的促進作用。據不完全統計，已報道的常見蘭科植物菌根真菌有69屬，分別隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）及毛霉門（Mucoromycota）的50科（王美娜等，2021）。

此外，蘭科植物的內生菌中還存在大量有益的內生細菌，這些有益的內生細菌對蘭科植物的生長發育也發揮著積極的促進作用，Tsavkelove等（2007）研究表明內生細菌能促進蘭科植物種子萌發、光合形態建成、緩解非生物脅迫及生長發育等。目前，關于蘭科植物根部細菌結構和功能的認知還非常有限（Kaur et al.， 2021 ）。從蘭科植物中分離出的細菌通常屬于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），不同的內生細菌類群對蘭科植物具有不同程度的促進作用，Faria等（2013）研究發現，類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）能促進Cattleya loddigesii 幼苗的生長。從蘭屬（Cymbidium sp.）根中分離出的根瘤菌屬（Rhizobium）能溶解磷酸鈣。此外，Tarkka等（2008）研究表明，蘭科植物菌根中存在菌根輔助細菌（mycorrhiza helper bacteria），能與菌根真菌特異性結合，刺激菌根真菌的孢子萌發和菌絲生長，促進菌根真菌在宿主植物中定殖和生長，加強菌根化，從而促進植物生長及增強抗逆性（陳耀麗等，2019；Wang et al.， 2021）。因此，加強蘭科植物內生細菌的研究，在蘭科植物的相關微生物研究中顯得非常重要。

管葉槽舌蘭（Holcoglossum kimballianum）隸屬于蘭亞科（subfamily Orchidoideae）萬代蘭族（tribe Vandeae）槽舌蘭屬（Holcoglossum），分布在中國的云南以及緬甸、泰國，常附生在山地林中的樹干上，海拔一般在1 000 m以上，具有較高的觀賞價值，瀕危等級為EN（瀕危），其野生種群亟需保護。目前，對管葉槽舌蘭的研究主要集中在系統發育、生物地理學和細胞學等方面，對其根部內生菌的研究鮮有報道。另外，Harrison等（2016）針對植物內生微生物的研究在采樣時為方便野外作業經常采用硅膠干燥的方法，這有可能會引起根內微生物群落的極大變化。因此，本研究采用ITS和16S高通量測序技術的方法，對管葉槽舌蘭新鮮及硅膠干燥根樣中的內生真菌和內生細菌群落進行研究，擬探討：（1）管葉槽舌蘭根樣內生菌類群的多樣性；（2）管葉槽舌蘭新鮮根樣與干燥根樣中內生菌群落的差異；（3）管葉槽舌蘭根樣內生細菌和真菌的比較。本研究為管葉槽舌蘭的種植及種質資源保護提供了內生真菌和細菌方面的數據，同時為研究蘭科植物根內微生物提供采樣處理的依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預處理

在深圳市蘭科植物保護研究中心，采集遷地保護狀態下的管葉槽舌蘭生長健康的根，在不影響管葉槽舌蘭正常生長的情況下，每個樣品取3～5條長2～5 cm的根段，盡量由3株以上的管葉槽舌蘭根樣組成，采集的同一組根樣分別做新鮮及干燥根樣的預處理。新鮮根樣預處理在根段取材后即刻進行，步驟如下：用流水沖洗根表面后，用5%次氯酸鈉和75%酒精依次消毒2 min，加入無菌水，洗凈棄廢液，將預處理后得到的最后一次無菌水進行DNA提取和風險建庫測試，未得到任何結果表明樣品得到了很好的預處理。將新鮮根樣置于-80 ℃冰箱以備提取微生物組DNA。將干燥根樣在預處理后放入硅膠中干燥72 h，備用。每個處理重復8次。

1.2 根內微生物組DNA提取、PCR擴增、文庫構建及HiSeq測序

使用QIAGEN PowerLyzer試劑盒對根內微生物組DNA進行提取。內生真菌選擇帶Barcode的特異引物（ITS5-1737F： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG和ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC），內生細菌選擇帶Barcode的特異引物（fM1：CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT和rC5：TAATCCTGTTTGCTCCCCAC）進行PCR擴增（Bellemain et al.， 2010；Yu et al.， 2013）。反應程序：98 ℃預變性1 min；進入30個擴增循環［98 ℃ 10 s，50 ℃（真菌）、55 ℃（細菌）30 s，72 ℃ 30 s］；72 ℃延伸5 min。反應體系（30 μL）：2 × Phusion Master Mix（New England Biolabs）15 μL，Primer（2 μmol·L-1）3 μL，gDNA 10 ng，補充H2O至30 μL。使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，PCR產物膠回收純化后使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，利用Illumina HiSeq 2500 PE 250平臺進行測序（北京諾禾致源生物科技有限公司）。

1.3 數據分析

測序數據截去Barcode和引物序列后，使用FLASH（Version 1.2.7）進行拼接，得到Raw Tags后使用fastp軟件對Raw Tags進行過濾得到高質量的Clean Tags。參照Qiime（V1.9.1）的Tags質量控制流程和去除嵌合體處理后得到有效數據Effective Tags。利用Uparse軟件（V 7.0.1001）以97%的一致性對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類得到OTUs，對出現頻數最高的OTUs代表序列采用Qiime軟件（V 1.9.1）中的Blast和Mothur方法與真菌數據庫Unite和細菌數據庫Silva進行物種注釋分析，統計各樣本的群落組成。以樣本中數據量最少的為標準進行均一化處理后，基于Qiime軟件計算α多樣性指數及β多樣性指數，并進行t-test差異顯著性檢驗。利用R軟件的VennDiagram包和Vegan包進行維恩圖及無度量多維標定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）分析。為進一步挖掘分組樣本間的差異顯著性真菌和細菌類群，選用Metastat、LEfSe統計分析方法對分組樣本的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗。對所有樣品的相關性指數（斯皮爾曼相關系數SCC）進行計算后，用cutoff＝0.6對相關系數的絕對值進行過濾，結合物種豐度構建共發生網絡（Network）圖。

2 結果與分析

基于Illumina HiSeq測序技術，從16個管葉槽舌蘭根部ITS共獲得2 834 046條有效Tags，有效Tags范圍為164 665～187 236。從管葉槽舌蘭根部16S共獲得2 375 402條有效Tags，有效Tags范圍為122 886～161 516。

2.1 內生菌群落物種組成和采樣處理對其影響

注釋結果發現，新鮮管葉槽舌蘭注釋到的根內生真菌有6門46科51屬，其中子囊菌門相對豐度為52.20%，擔子菌門相對豐度為20.22%，球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉門相對豐度在1%左右；而經硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內生真菌有6門88科116屬，其中子囊菌門相對豐度為57.84%，擔子菌門相對豐度為3.68%，球囊菌門、被孢霉門、毛霉門、羅茲菌門的相對豐度在1%以下。在2個分組中，子囊菌門都占絕對優勢。相比較而言，干燥后管葉槽舌蘭根樣內生真菌類群數量變多；新鮮管葉槽舌蘭根樣內生真菌群落中子囊菌門、球囊菌門占比低于硅膠干燥根樣中的內生真菌群落，而蘭科菌根真菌最多的擔子菌門明顯高于硅膠干燥根樣中的內生真菌群落（圖1：a）。經硅膠干燥后，管葉槽舌蘭根內生真菌在科水平（圖1：b）的相對豐度發生了改變，曲霉科（Aspergillaceae）在干燥后豐度明顯降低，而枝孢霉科（Cladosporiaceae）在干燥后豐度明顯升高，小叢殼科（Glomerellaceae）和膠膜菌科（Tulasnellaceae）的相對豐度在經硅膠干燥后的根樣品中的豐度幾乎為零。在屬水平上（表1，圖1：c），管葉槽舌蘭根內生真菌的相對豐度發生了改變，青霉屬（Penicillium）、Aporospora、瘤菌根菌屬（Epulorhiza）經干燥后的豐度降低，而枝孢屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和Mycoacia在干燥后豐度明顯升高，小脆柄菇屬（Psathyrella）和刺盤孢屬（Colletotrichum）的相對豐度經硅膠干燥后的豐度為零。從排名前15的硅膠干燥處理前后管葉槽舌蘭根部內生真菌屬水平絕對豐度值變化可以看出，青霉屬、瘤菌根菌屬、Keissleriella及亞隔孢殼屬（Didymella）在干燥后豐度值降低，其余屬如Aporospora、枝孢屬、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、紅菇屬（Russula）和鏈格孢屬（Alternaria）等在干燥后豐度值增加，而小脆柄菇屬和刺盤孢屬在經硅膠干燥后的根部樣品的豐度值為零。這與管葉槽舌蘭根內生真菌在屬水平的相對豐度變化趨勢總體相似。

根據OTUs聚類結果（本文將未注釋到的OTU包含在內一起計算，下同），繪制OTUs韋恩圖（圖1：g），結果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌特有的OTUs有56個，主要是子囊菌門（16個OTUs）和擔子菌門（12個OTUs）；而經硅膠干燥后根樣中內生真菌有123個特有OTUs，主要隸屬于子囊菌門（47個OTUs），擔子菌門僅有10個OTUs；2個分組共有的OTUs僅有61個，其中有21個OTUs屬于子囊菌門，8個OTUs屬于擔子菌門。這表明干燥后的管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落在喪失掉新鮮根樣中的一些真菌類群的同時，也產生了相當數量的新的真菌類群，這些新產生的真菌主要隸屬于子囊菌門。

在內生細菌方面，新鮮管葉槽舌蘭根內生細菌注釋到15門105科178屬，其中變形菌門相對豐度為18.21%，藍藻門（Cyanobacteria）相對豐度為1.78%，厚壁菌門相對豐度為1.41%，放線菌門（Actinobacteria）相對豐度為1.14%，擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門（Spirochaetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度低于1%；而經硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內生細菌有21門154科336屬，其中變形菌門相對豐度為48.71%，厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度為8.31%，放線菌門相對豐度為5.67%，擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度為3.41%，藍藻門相對豐度為2.58%，螺旋體門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠彎菌門的相對豐度低于1%（圖1：d）。在2個分組中變形菌門豐度均占絕對優勢。相比較而言，干燥后管葉槽舌蘭根樣內生細菌類群數量同樣變多，經硅膠干燥后，占主要優勢的變形菌門、厚壁菌門、放線菌門細菌相對豐度均有明顯提高（圖1：d）。管葉槽舌蘭根內生細菌經硅膠干燥后在科水平（圖1：e）的相對豐度發生了改變，鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）等占比均明顯升高，而伯克氏菌科（Burkholderiaceae）在干燥后明顯降低。在屬水平上（表1，圖1：f），管葉槽舌蘭根內生細菌的相對豐度發生了改變，鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、副球菌屬（Paracoccus）和泛菌屬（Pantoea）在干燥后豐度明顯升高，而馬賽菌屬（Massilia）在干燥后明顯降低。從排名前15的硅膠干燥處理前后管葉槽舌蘭根內生細菌屬水平絕對豐度值變化表中可以看出馬賽菌屬和Rubrobacter在干燥后豐度值降低，其余屬如鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬和分支桿菌屬（Mycobacterium）等經干燥后豐度值都明顯增加，這與管葉槽舌蘭根內生細菌在屬水平的相對豐度變化趨勢相似。

根據OTUs聚類結果，繪制OTUs韋恩圖（圖1：h），結果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌特有的OTUs有751個，主要是藍藻門（33個OTUs）；而經硅膠干燥后根樣中內生細菌有579個特有OTUs，主要隸屬于厚壁菌門（100個OTUs）；2個分組共有的OTUs有532個，其中有127個OTUs屬于變形菌門，50個OTUs屬于藍藻門，36個OTUs屬于厚壁菌門，13個OTUs屬于擬桿菌門，1個OTUs屬于酸桿菌門，1個OTUs屬于螺旋體門。通過結果分析表明，相對于真菌來說，管葉槽舌蘭擁有更為豐富的內生細菌類群，同內生真菌一樣，經硅膠干燥后，其內生細菌群落在喪失掉新鮮根樣中的一些細菌類群的同時產生了相當數量的新的細菌類群，喪失的細菌主要隸屬于藍藻門，而新產生了大量的厚壁菌門。

2.2 內生菌群落多樣性差異分析

為對比新鮮與干燥管葉槽舌蘭根樣中的內生菌群落的豐富度和多樣性，對2組樣品內生菌群落的α多樣性進行比較分析，包括Chao 1、Shannon、Simpson等指數，Chao 1是計算群落中含OTU數目的指數，常用來指示群落物種豐富度，Shannon和Simpson是綜合考慮樣本中物種的豐富度與均勻度指數，用來表示群落多樣性。經分析發現，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落的Chao 1指數、Shannon指數、Simpson指數分別為39.797、3.070、0.723；硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落的Chao 1指數、Shannon指數、Simpson指數分別為62.348、3.715、0.785。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落的Chao 1指數明顯低于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落Shannon指數、Simpson指數略低于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落，水平相當。t-test檢驗表明，干燥前后3個α多樣性指數均無顯著性差異。這表明硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落多樣性水平相當，但干燥后物種數量明顯變多。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落的Chao 1指數、Shannon指數、Simpson指數分別為524.492、7.103、0.976；硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生細菌群落的Chao 1指數、Shannon指數、Simpson指數分別為321.154、6.543、0.973。經硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生細菌群落Chao 1指數遠低于新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落Shannon指數、Simpson指數高于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生細菌群落。t-test檢驗表明，干燥前后3個α多樣性指數除了Chao 1指數（Pt-test=0.008）外其他均無顯著性差異。這表明硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生細菌群落物種數量和多樣性明顯減少。這一結果與管葉槽舌蘭根樣內生真菌群落的正好相反。

為研究新鮮與干燥管葉槽舌蘭根樣中的內生菌群落的差異程度，對2組樣品內生菌群落的β多樣性進行比較分析?；赪eighted Unifrac的β多樣性分析發現，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌的β多樣性高于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落的；而內生細菌基于Weighted Unifrac的β多樣性分析發現，硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落的β多樣性要高于新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌的，t-test檢驗發現，干燥前后β多樣性指數無顯著性差異。為進一步衡量硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根內生真菌與內生細菌群落間的差異，進行NMDS分析?；赪eighted Unifrac的NMDS分析發現，新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內生真菌與細菌群落具有明顯分區。分析表明新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內生真菌與細菌群落的β多樣性指數無顯著性差異，而在物種組成上卻具有明顯不同。

2.3 差異顯著性內生菌類群分析

為研究硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根樣中內生真菌與細菌群落間是否具有顯著性差異的物種，利用Metastat和LEfSe分析篩選具有顯著性差異的物種。MetaStat分析表明，硅膠干燥前后，管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落的差異顯著性真菌有擔子菌門小脆柄菇屬的黃蓋小脆柄菇（Psathyrella candolleana）及子囊菌門刺盤孢屬的Colletotrichum tofieldiae，這2個顯著性差異物種只存在于新鮮管葉槽舌蘭根樣的內生真菌群落中（圖4：a、b，表1）；LEfSe分析發現，新鮮及干燥管葉槽舌蘭根樣均具有各自的差異顯著性內生細菌類群。新鮮管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內生細菌類群為馬賽菌屬，而干燥管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內生細菌類群較多，在科和屬水平上有拜葉林克氏菌科、黃色桿菌科及慢生根瘤菌屬（圖4：c、d）。

2.4 共發生網絡（Co-occurrence Network）分析

對新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落和硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落進行共發生網絡分析，結果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落共發生網絡中的物種主要分布在子囊菌門、擔子菌門及Mortierellomycota。其中，占互作主導地位的優勢屬主要有瘤菌根菌屬、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、假尾孢菌屬（Pseudocercospora）、Vishniacozyma及Aporospora等（圖5：a）。硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落共發生網絡中的物種分布在子囊菌門、擔子菌門、Mortierellomycot和毛霉門。其中，占互作主導地位的優勢屬主要有Vishniacozyma、Stephanonectria、彎頸霉屬（Tolypocladium）、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）、Archaeorhizomyces及假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）等（圖5：b）。在內生細菌方面，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落共發生網絡中的物種主要分布在梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門、放線菌門、藍藻門、擬桿菌門、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、酸桿菌門和變形菌門。其中，占互作主導地位的優勢屬主要有：芽孢桿菌屬、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、不動桿菌（Acinetobacter）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、Psychroglaciecola、Parabacteroides、異常球菌屬（Deinococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等（圖5：c）。硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內生細菌群落共發生網絡中的物種則分布在厚壁菌門、放線菌門、裝甲菌門（Armatimonadetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、擬桿菌門、藍藻門、螺旋體門、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、變形菌門、綠彎菌門、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門和棲熱菌門。其中，占互作主導地位的優勢屬主要有熱解糖梭菌屬（Thermoanaerobacterium）、Mucilaginibacter、微球菌屬（Micrococcus）、異常球菌屬、Fimbriiglobus、Sphaerochaeta（圖5：d）。

綜上結果分析表明，同新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內生菌群落相比，硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣的內生菌群落中占互作主導地位的優勢物種、密切作用的菌類群、豐度及互作模式都發生了改變。同時，與內生真菌群落相比，無論是干燥前還是干燥后管葉槽舌蘭根內生細菌共發生網絡中密切互作的類群及節點均遠遠多于內生真菌群落，表明管葉槽舌蘭根內生細菌群落具有比真菌更為活躍的相互作用。

3 討論與結論

3.1 管葉槽舌蘭的菌根真菌與菌根細菌

管葉槽舌蘭根內生真菌主要隸屬于子囊菌門、擔子菌門、球囊菌門、毛霉門和Mortierellomycota。這一結果與前人研究的蘭科植物根內生真菌群落結構的分析結果相同（蔣玉玲等，2018；艾葉等，2019）。本研究發現，新鮮管葉槽舌蘭根樣內占有較高豐度的曲霉科、小叢殼科和膠膜菌科，這3個真菌科被報道是蘭科植物的菌根真菌科（Zelmer et al.， 1996；Yuan et al.， 2010），其中膠膜菌科是最常見的蘭科植物菌根真菌科，與許多蘭科植物形成廣泛的菌根關系（Shao et al.， 2020；Wang et al.， 2022）。在屬水平上，管葉槽舌蘭根樣內生真菌的優勢屬有青霉屬、小脆柄菇屬、刺盤孢屬、Aporospora和瘤菌根菌屬，這些真菌類群均被報道是蘭科植物的菌根真菌（王美娜等，2021）。李明等（2006）采用根組織切片法調查碧玉蘭（Cymbidium lowianum）的菌根真菌，初步鑒定包括青霉屬、鏈霉屬等。Yamato等（2005）對虎舌蘭（Epipogium roseum）根內菌根真菌進行研究發現，優勢屬為小脆柄菇屬和鬼傘屬（Coprinus）。Chen等（2012）用分離培養和分子系統學方法對金釵石斛（Dendrobium nobile）和束花石斛（D. chrysanthum）根部內生真菌進行研究，發現刺盤孢屬是兩種石斛屬的優勢屬。在金釵石斛、硬葉兜蘭（Paphiopedilum wardii）和杏黃兜蘭（P. armeniacum）的根中都分離到瘤菌根菌屬，并將其回接到3種蘭科植物的組培苗中，發現瘤菌根菌屬能夠促進無菌苗的生長，并且提高金釵石斛無菌苗的總生物堿和多糖的含量（陳曉梅等，2005；朱鑫敏等，2012）。Tan等（2012）從9種野生槽舌蘭屬植物的根內生真菌中分離出46株可培養的內生真菌，隸屬于16屬，包括鏈格孢屬、枝孢屬、瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、刺盤孢屬、亞隔孢殼屬、Stephanonectria、Phomopsis、擬隱孢殼Cryptosporiopsis、Leptosphaeria、Pyrenochaeta、Clonostachys、Cosmospora、柱孢屬Cylindrocarpon、Myrmecridium和Paraconiothyrium，其中9個屬在本研究的管葉槽舌蘭根樣內生真菌中被注釋到，表明本研究的管葉槽舌蘭與同屬植物中的內生真菌群落具有一定的相似性，瘤菌根菌屬和鐮刀菌屬是9種野生槽舌蘭屬植物主要的內生真菌。由此推測，這些真菌類群是對管葉槽舌蘭有益的菌根真菌。

管葉槽舌蘭根內生細菌主要隸屬于變形菌門、藍藻門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、螺旋體門、酸桿菌門和綠彎菌門。其中，變形菌門、厚壁菌門、藍藻門和放線菌門等是最為常見的蘭科植物內生細菌門，變形菌門有利于生長素的合成（Tsavkelova et al.， 2007a）。Tsavkelova等（2003）在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）、杓唇石斛（Dendrobium moschatum）和短序脆蘭（Acampe papillosa）中都分離出的兼顧固氮性和光合作用的藍藻門，厚壁菌門中的芽孢桿菌屬能防止葉斑病，促進種子的萌發和植株生長，減少幼苗壞死（程萍等，2008; White et al.， 2014）。在蝴蝶蘭（Girija et al.， 2018）和鐵皮石斛（Yu et al.， 2013）中均有報道螺旋體門和綠彎菌門，但其豐度較低。本研究發現，新鮮管葉槽舌蘭根樣內豐度較高的伯克氏菌科在干燥后的根樣中豐度明顯下降。Galdiano等（2011）從Cattleya walkeriana中分離出的腸桿菌科和伯克氏菌科等細菌發現，它們能促進生長并提高植株的存活率。在屬水平上，管葉槽舌蘭根樣內生細菌的優勢屬主要有馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬，馬賽菌屬不僅能合成各種次級代謝產物和酶，還有溶磷、降解菲和耐受重金屬等功能（Zheng et al.， 2017；楊恩東等，2019）。鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬是許多蘭科植物的優勢菌，Tsavkelova等（2007）將杓唇石斛根部分離的鞘氨醇菌屬接種于杓唇石斛種子發現，鞘氨醇菌屬極大提高了種子萌發率；鞘氨醇菌屬還能固定氮，并增加幼苗的生長和生物量（Yang et al.， 2014）。假單胞菌屬被報道是Pterostylis vittata根系的優勢屬，可以產生激素來促進植物吸收營養物質（Wilkinson et al.， 1989；黃騰飛，2012），并有助于真菌在植株根部的定殖，促進蘭花菌根的形成（張萍和宋希強，2012）。童文君等（2014）對美花石斛（Dendrobium loddigesii）內生細菌進行分離鑒定發現，腸桿菌屬為優勢屬。

綜上所述，結合前人研究及本文結果推測，青霉屬、小脆柄菇屬、刺盤孢屬和瘤菌根菌屬等內生真菌是管葉槽舌蘭的菌根真菌；而馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬等可能是管葉槽舌蘭的“菌根細菌”。這些優勢菌群可能在管葉槽舌蘭的種子萌發、生長發育過程中起著重要的作用，在今后的研究中，可重點關注這些內生菌類群分離培養，及其與管葉槽舌蘭的互利共生機理研究。

3.2 管葉槽舌蘭根內生菌類群與多樣性水平

管葉槽舌蘭的根樣內生真菌中共得到117個OTUs，Jacquemyn等（2016）采用454測序平臺對火燒蘭屬（Epipactis）3個物種根內真菌進行研究共得到105個OTUs，3個物種OTUs范圍為42～58，OTUs數量低于本研究管葉槽舌蘭根內真菌OTUs的數量。Park等（2018）基于454測序平臺對蝦脊蘭屬（Calanthe）6個物種的根內真菌進行研究，在每個樣本中得到的OTUs數量范圍為22～57，遠低于本研究OTUs數量的水平。本研究中，管葉槽舌蘭根內真菌群落的α多樣性指數Chao 1為39.797，Shannon指數為3.070，Simpson指數為0.723。Zeng等（2021）用Illumina MiSeq平臺對白芨（Bletilla striata）、黃花白芨（B. ochracea）和小白芨（B. formosana）3種白芨屬植物的根內真菌研究發現，內生真菌群落的α多樣性指數Chao 1分別為94、73、39；Shannon指數為2.35、1.76、1.89；Simpson指數為0.26、0.32、0.30。本研究中，管葉槽舌蘭根內真菌群落的Shannon指數和Simpson指數均高于3種白芨屬蘭科植物根內真菌群落的多樣性水平，但它們的Chao l指數要比本研究中管葉槽舌蘭根內真菌群落的高。Tan等（2012）基于分離培養和ABI 3730測序平臺對9種野生槽舌蘭屬植物的根內生真菌研究發現，9種野生槽舌蘭屬植物的內生真菌Shannon多樣性指數最高的是在短距槽舌蘭（Holcoglossum flavescens）中（為1.913），野生管葉槽舌蘭Shannon多樣性指數是0.993 8，最低的是舌唇槽舌蘭（H. lingulatum）（為0.950 3），本研究中的管葉槽舌蘭根內真菌群落的Shannon指數均高于9種野生槽舌蘭屬植物根內真菌群落的多樣性水平。通過分析表明，遷地保育狀態的管葉槽舌蘭有著與野生管葉槽舌蘭和其他野生蘭科植物相當的內生真菌數量或多樣性水平。

管葉槽舌蘭的根樣中內生細菌共得到1 283個OTUs、Chao 1指數為524.492、Shannon指數為7.103、Simpson指數為0.976，吳慶珊等（2018）從3個樣地金釵石斛（Dendrobium nobile）的根莖葉中共分離出1 082株內生細菌，可分為41個OTUs，共有OTUs有14個；陳澤斌等（2016）基于16S高通量測序從白芨中獲得48個OTU，數量遠低于本研究管葉槽舌蘭根內細菌OTUs的數量。Ou等（2017）采用基于16S rRNA和nifH基因的元基因組焦磷酸測序技術，對中國5個地區的鐵皮石斛相關菌群和重氮化菌群進行了研究，結果發現其OTUs范圍在597～3 023之間，Shannon指數范圍為4.35～6.49。相比較而言，本研究所得到的管葉槽舌蘭根內細菌OTUs的數量處于中間水平，Shannon指數高于鐵皮石斛的Shannon指數。謝泰祥等（2020）采用高通量測序技術分析福州鼓山野生建蘭（Cymbidium ensifolium）根樣內生細菌發現，建蘭根內細菌群落的α多樣性Chao 1指數為700.99、Shannon指數為6.10、Simpson指數為0.95，本研究中的管葉槽舌蘭根內細菌群落的Chao l指數與野生建蘭Chao l指數相當，Shannon指數及Simpson指數則是高于建蘭的根內細菌群落。這表明遷地保育狀態的管葉槽舌蘭有著與其他野生蘭科植物相媲美的內生細菌的豐富度和多樣性水平。

3.3 新鮮樣品與干燥樣品對研究內生菌群落的影響

在處理微生物組樣品時，如何減少從樣品采集到預處理再到儲存的過程中原始微生物群落的變化至關重要（Kim et al.， 2017）。本研究對比了管葉槽舌蘭新鮮與干燥根樣中內生菌群落的變化。從新鮮管葉槽舌蘭注釋到根內生真菌有6門46科51屬共117個OTUs，注釋到根內生細菌15門105科178屬共1 283個OTUs；而經硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內生真菌有6門88科116屬184個OTUs，注釋到根內生細菌21門154科336屬共1 111個OTUs，新鮮樣品與干燥樣品根部內生菌群落物種構成相差非常大。對管葉槽舌蘭新鮮根樣與干燥根樣中內生菌群落進行α多樣性與β多樣性、共發生網絡等分析發現，與新鮮根樣相比干燥后的管葉槽舌蘭根內生菌群落的OTUs數量、物種類群及豐度、α多樣性、β多樣性及互作模式均發生了改變。

本研究還發現，在新鮮根樣中的菌根真菌類群如小叢殼科和膠膜菌科，它們在干燥根樣中的相對豐度幾乎為零。在屬水平上，青霉屬、瘤菌根菌屬、Keissleriella及亞隔孢殼屬在干燥后豐度值降低，而枝孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬、紅菇屬和鏈格孢屬等在干燥后豐度值增加。差異顯著性物種分析也發現在兩種采樣處理中具有顯著差異的擔子菌門小脆柄菇屬的黃蓋小脆柄菇和子囊菌門刺盤孢屬的Colletotrichum tofieldiae僅存在于新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內生真菌群落。由此推測，瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、小脆柄菇屬和刺盤孢屬是管葉槽舌蘭的益生真菌。管葉槽舌蘭菌根真菌在干燥的根樣中豐度下降或消失的原因可能是管葉槽舌蘭的菌根真菌對宿主有一定的依賴性，健康生長的管葉槽舌蘭可為其菌根真菌提供養分以供其生長，而當宿主死亡后，這些菌根真菌失去營養來源而逐漸死亡。

在內生細菌方面，馬賽菌屬和Rubrobacter在干燥后豐度值降低，而鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬和分支桿菌屬等經干燥后豐度值都明顯增加。這些細菌可能在干燥環境中獲得適宜的培養條件從而豐度升高。干燥管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內生細菌類群較為豐富，有拜葉林克氏菌科、黃色桿菌科及慢生根瘤菌屬。新鮮管葉槽舌蘭細菌群落中差異顯著性細菌類群是馬賽菌屬。由此推測，馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、分支桿菌屬及慢生根瘤菌屬是管葉槽舌蘭的益生細菌。干燥可能會引起細菌脫水，進而使細菌活力下降（Berninger et al.， 2018；Majidzadeh et al.， 2022）。Moreira等（2021）對乳酸菌（LAB）培養物經過干燥處理，發現干燥會增加乳酸菌細胞的損傷，導致培養活力的喪失和細胞保護能力的改變。

綜上結果表明，硅膠干燥的采樣處理會顯著改變內生菌群落OTUs數量、物種類群及豐度、α多樣性、β多樣性和互作模式，且會導致根內某些關鍵真菌及細菌類群尤其是菌根真菌和菌根細菌的丟失和變化，影響數據的完整性和準確性。因此，針對蘭科植物根樣內生菌的研究應使用新鮮的根樣。

3.4 管葉槽舌蘭根內生細菌和真菌的比較

本研究的管葉槽舌蘭根樣中內生真菌群落的OTUs有117個，Chao 1指數、Simpson指數和Shannon指數分別為39.797、0.723和3.070。而內生細菌群落有1 283個OTUs，Chao l指數、Simpson指數和Shannon指數分別為524.492、0.976、7.103。管葉槽舌蘭根樣內生細菌群落的豐富度和多樣性要遠比內生真菌群落的高，內生細菌可能有著遠比已有認知對管葉槽舌蘭更為重要的作用。蘭科植物內生細菌與真菌的協作對宿主植物的生長具有重要意義（張芳芳等，2016），王小明等（2016）把鐵皮石斛中分離得到的真菌和細菌進行組合，對鐵皮石斛幼苗進行真菌+細菌聯合接種，與未接種和單獨接種處理相比，真菌+細菌組合對鐵皮石斛幼苗生長的影響存在顯著差異。張萍（2012）采用平板對峙法對鐵皮石斛6株促生內生細菌與8株促生內生真菌進行促生組合的研究結果顯示，某些細菌與真菌組合后處理苗的各個指標均有所提高，與單一接菌的處理苗均形成顯著性差異，特定的真菌或細菌組合表現出協同效應或累加效應。推測管葉槽舌蘭根部真菌和細菌的相互作用可能共同影響管葉槽舌蘭的生長發育，其相互作用的機制有待進一步研究和驗證。

管葉槽舌蘭作為一種珍稀瀕危的蘭科植物，根系內生菌在管葉槽舌蘭種子萌發、幼苗形成、生長發育過程中起著重要的作用。本研究結果可為進一步采用菌根技術實現管葉槽舌蘭種質保育提供理論基礎，對管葉槽舌蘭的保護與生產栽培具有重要意義，同時，也為蘭科植物內生微生物的采樣方法提供參考。

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（責任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2022-11-10

基金項目：? 國家自然科學基金（32001245）； 深圳市可持續發展專項（KCXFZ20211020164200001）; 深圳市科技計劃項目（JCYJ20210324123013037）。

第一作者： 張鎮梁（1997-），碩士研究生，研究方向為植物保護，（E-mail）2399308611@qq.com。

*通信作者：? 喬琦，博士，教授，研究方向為植物保護生物學，（E-mail）nxyqiao@163.com。