鐵皮石斛SPL膜結合(STM)轉錄因子的全基因組鑒定及表達分析

楊樂　聶聰　龍小琴　何基澤　顏超越　朱乾坤　王萬軍

摘 要：? SPL轉錄因子廣泛參與植物生長發育、脅迫響應等過程。目前，沒有關于鐵皮石斛SPL膜結合（SPL with transmembrane motif）轉錄因子即STM轉錄因子的研究。為了探究STM轉錄因子在鐵皮石斛生長發育及脅迫響應等方面的作用，該文在鐵皮石斛全基因組水平鑒定出4個STM轉錄因子，并對DoSTM基因家族成員進行生物信息學分析，又利用逆轉錄PCR研究了DoSTM在不同組織部位及不同逆境處理下的表達情況。結果表明：（1）DoSTM1-4為親水蛋白，均具有SBP保守結構域和一些激素響應位點。（2）4個DoSTM在根莖葉中均有表達，DoSTM2在葉中的相對表達量最低；DoSTM1/3/4的相對表達水平均無明顯差異。（3）DoSTM1-4在低溫、高溫、干旱脅迫下的相對表達水平都有顯著變化，DoSTM1/3/4的表達量降低最為明顯，故推測DoSTM與植物體內激素響應、溫度變化響應及抗旱性有關。這些結論為后續進一步開展鐵皮石斛STM轉錄因子的研究提供了參考。

關鍵詞： 鐵皮石斛， STM轉錄因子， 基因鑒定， 功能分析， 基因表達

中圖分類號：? Q943 文獻標識碼：? A 文章編號：? 1000-3142（2023）06-1041-10

Genome-wide identification and expression analysis of SPL with transmembrane motif （STM） transcription factor in Dendrobium officinale

YANG Le， NIE Cong， LONG Xiaoqin， HE Jize， YAN Chaoyue， ZHU Qiankun， WANG Wanjun*

（ School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China ）

Abstract：? SPL transcription factors are widely involved in plant growth and development， stress response and so on. At present， there is no study on the? STM （SPL with transmembrane motif） transcription factor in Dendrobium officinale. In order to explore the role of STM in the growth， development and stress response of D. officinale， four STM transcription factors were identified at the whole genome of D. officinale， and bioinformatics analysis of DoSTM gene family members were carried out. The expression of DoSTM in different tissue parts and different stress treatments were studied by reverse transcription PCR. The results were as follows： （1）DoSTM1-4 were hydrophilic proteins with SBP conserved domains and some hormone response sites. （2）Four DoSTM were expressed in root， stem and leaf， and the relative expression of DoSTM2 was the lowest in leaf; there was no significant differences in the relative expression level of DoSTM1/3/4. （3）The relative expression level of DoSTM1-4 changed significantly under low temperature， high temperature and drought stress， and the expression of DoSTM1/3/4 decreased most significantly. Therefore， it is speculated that DoSTM is related to hormone response， temperature change response and drought resistance in plants. These conclusions provide the reference for the further research on STM transcription factor of D. officinale.

Key words： Dendrobium officinale， STM transcription factor， gene identification， functional analysis， gene expression

石斛主要分布在東南亞和大洋洲的熱帶及亞熱帶地區，喜生長在溫暖潮濕的環境中，附著在樹干或巖石上 （羅凱等，2021）。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生草本植物，具有極高藥用價值，是一種藥食兩用中藥材，其成分主要包括多糖類、生物堿類、黃酮類以及酚酸類等，在抗腫瘤和增強免疫力等方面具有功效 （唐文文等，2021）。近年來由于過度挖采導致野生資源大量減少，故從分子水平研究鐵皮石斛的生長發育對其保育有重要意義 （曾丹琦等，2021）。

SPL（squamousa promoter binding protein like）基因家族作為植物特有的一類轉錄因子，主要通過結合下游基因啟動子區的順式作用元件來調控下游基因表達。SPL轉錄因子在植物的生長發育、信號傳導、脅迫響應等方面有著重要的作用 （吳艷等，2019）。這類轉錄因子最早在金魚草中被發現（Huijser et al.， 1992）。之后有更多研究發現SPL轉錄因子在植物生長發育以及在脅迫響應中起著重要作用 （Yu et al.， 2015; Xu et al.， 2016）。在甘藍型油菜的愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果中有大量BoSPL表達，并且這些基因可能在甘藍耐寒性中起重要作用 （Shan et al.， 2021）。據最近報道，擬南芥SPLs可能參與其從幼年到成年的營養轉化、生殖期的形態變化、花青素生物合成和防御脅迫 （Jiang et al.， 2021）。其中，SPL3在花序和花器官的發育中發揮重要作用 （Gandikota et al.， 2007），在各種低磷脅迫反應以及低磷條件下磷饑餓誘導基因表達中都有SPL1的參與介導 （雷凱健等，2016）。

轉錄因子的研究是植物分子生物學的重要內容，在植物抗逆等方面起著重要作用。轉錄因子和基因順式作用元件的相互作用激活了相關抗逆基因的表達，提高了植物的抗逆性。有一類特殊的轉錄因子存在，因其含有一段跨膜區被稱為膜結合轉錄因子，可直接整合在細胞內的膜結構上 （如細胞質膜、內質網膜、核膜等），一般處于休眠狀態，當受到外界環境變化刺激后，膜結合轉錄因子便從膜上釋放，轉變為激活狀態，并轉運到細胞核內行使功能 （王楠等，2016）。SPL轉錄因子中也有這類膜結合轉錄因子，且目前并沒有專門研究SPL膜結合轉錄因子的報道，因此，本研究通過BLASTP在鐵皮石斛全基因組中鑒定出4個SPL膜結合轉錄因子，命名為DoSTM （SPL with transmembrane motif）轉錄因子，并進行后續生物信息學及表達分析。

1 材料與方法

1.1 材料

將鐵皮石斛幼苗分別置于1/2MS培養基、含100 mmol·L-1 NaCl的1/2MS液體培養基、含5 μmol·L-1脫落酸的1/2MS液體培養基、質量分數為10% PEG的1/2MS液體培養基、40 ℃ 1/2MS液體培養基、4 ℃ 1/2MS液體培養基中處理6 h，吸干水分后將幼苗按200～300 mg裝入1.5 mL離心管中，并做好標記，迅速置于液氮中1 min，取出放入-80 ℃冰箱保存待用。以盆栽鐵皮石斛幼嫩的根莖葉組織作為原材料，進行根莖葉差異表達分析。

1.2 試劑

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京擎科）、瓊脂糖（北京擎科）、2×TSINGKE Master Mix（北京擎科）、RNA無酶水（北京擎科）、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNASynthesis Kit試劑盒（寶生物）、50×TAE（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛STM蛋白的理化性質及亞細胞定位分析 從NCBI數據庫中下載擬南芥STM蛋白序列，將物種限定在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）并進行BLAST搜索，下載搜索到的鐵皮石斛的STM蛋白序列，去除冗余序列，利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測跨膜結構域，最終選取XP_020685848、XP_020681923、XP_020672795、XP_020688542這4個蛋白進行研究，并分別命名為DoSTM1、DoSTM2、DoSTM3、DoSTM4。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析鐵皮石斛STM蛋白家族的理化性質。用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/） （Chou & Shen， 2007）對DoSTM蛋白家族進行亞細胞定位分析。

1.3.2 鐵皮石斛STM家族的系統進化樹分析 從NCBI數據庫中下載野蕉 （Musa balbisiana）、鐵皮石斛 （Dendrobium officinale）、擬南芥 （Arabidopsis thaliana）、蝴蝶蘭 （Phalaenopsis equestris）、毛白楊 （Populus tomentosa）、扇形文心蘭 （Erycina pusilla）、玉米 （Zea mays）、水稻 （Oryza sativa）、生姜 （Zingiber officinale）的STM蛋白序列Fasta格式。用MEGA-X鄰近法構建進化樹，序列比對采用ClustalW，選擇Bootstrap method，Bootstrap replications選擇500，Model選擇p-distance，Gaps/Missing Data Treatment選擇Partial deletion，Site Coverage Cutoff設定為50，進行建樹。建樹結果在ITOL（https：//itol.embl.de/）中進行美化。

1.3.3 鐵皮石斛STM蛋白質二級結構預測 利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線網站對鐵皮石斛STM蛋白質的二級結構進行分析，參數為默認值。

1.3.4 鐵皮石斛STM蛋白質序列比對及保守基序分析 將4個DoSTM蛋白導入MEME （Bailey & Elkan et al.， 1994）在線網站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行分析，將motifs的數量設定在10，其他參數默認，進行分析。將鐵皮石斛STM蛋白序列Fasta格式導入MEGA-X中進行構樹，序列比對采用ClustalW，選擇Bootstrap method，Bootstrap replications選擇500，Model選擇p-distance，Gaps/Missing Data Treatment選擇Partial deletion，Site Coverage Cutoff設定為50，進行構樹。從NCBI數據庫中下載鐵皮石斛STM蛋白的CDD，利用TBtools （Chen et al.， 2020）對DoSTM保守基序、保守結構域、進化樹進行繪圖。將鐵皮石斛STM蛋白的ClustalW比對結果導入ESPript 3.0在線網站（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行分析。

1.3.5 鐵皮石斛STM基因結構及順式作用元件分析 從NCBI數據庫中下載鐵皮石斛的基因組信息，用TBtools進行基因結構繪制，同時獲得啟動子上游2 000 bp的序列信息，獲得的序列信息用PlantCARE （Lescot et al.， 2002）網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測，并用TBtools進行繪圖。

1.3.6 引物設計 利用4個DoSTM的cDNA序列，將所得的cDNA序列用Primer-BLAST進行引物設計，引物大小設定為18～22 bp，PCR產物大小設定為400～800 bp，其他參數均為默認參數，在輸出的引物中選擇靠近3′端的作為試驗所用引物，選用EF1-α做內參，相應的引物序列如表1所示。

1.3.7 鐵皮石斛STM基因表達分析 將鐵皮石斛幼苗分別置于1/2MS液體培養基、含100 mmol·L-1 NaCl的1/2MS液體培養基、含5 μmol·L-1 脫落酸的1/2MS液體培養基、含10%PEG的1/2MS液體培養基、40 ℃ 1/2MS液體培養基、4 ℃ 1/2MS液體培養基中處理6 h，迅速置于液氮中1 min，取出放入-80 ℃冰箱保存待用。首先，用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取6種處理的鐵皮石斛幼苗的RNA和鐵皮石斛幼苗根莖葉的RNA，并用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第一鏈的合成。然后，以cDNA第一鏈為模板，2×TSINGKE Master Mix及引物進行PCR擴增。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火15s，72 ℃延伸1 min，變性-退火-延伸30個循環；72 ℃繼續延伸10 min。最后，進行1%凝膠電泳，拍照記錄電泳條帶。

1.3.8 數據處理及分析 用ImageJ測定電泳條帶的灰度值，Excel對所得灰度值進行處理，將處理后的數據導入GraphPad Prism 5中進行分析及作圖，分析方法選用Students t-test，顯著水平均設為0.05。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛STM蛋白家族理化性質及亞細胞定位分析

DoSTM蛋白家族的理化性質分析結果表明，DoSTM1-4的氨基酸數目分別為1 025、977、1 104、830，相對分子質量分別為113.53、109.09、121.67、93.177；等電點pI在6.07～8.06之間；不穩定系數在44.37～58.41之間，較為不穩定；脂肪系數在78.15～83.04之間；總平均親水系數均為負數，在-0.405～-0.335之間，表明DoSTM蛋白均為親水蛋白質（表2）。亞細胞定位預測結果顯示DoSTM1-3定位在細胞核，DoSTM4定位在葉綠體。將篩選到的鐵皮石斛STM蛋白DoSTM1-4進行跨膜結構域預測 （圖1），結果顯示跨膜結構域位于C末端22個氨基酸殘基處。

2.2 鐵皮石斛STM基因家族的系統進化分析

系統進化分析顯示9個物種的34個STM蛋白聚為4組 （A-D）（圖2），A組的STM蛋白共有3個，B組的STM蛋白共有6個，C組的STM蛋白共有9個，D組的STM蛋白共有16個。其中，DoSTM1-2蛋白共同聚類在B組，有可能是較近發生的基因復制事件所造成；DoSTM4聚類在C組；DoSTM3蛋白聚類在D組。

2.3 鐵皮石斛STM蛋白的二級結構

對DoSTM蛋白質的二級結構進行分析，二級結構占比如表3所示，二級結構圖如圖3所示。結果表明，鐵皮石斛STM蛋白的二級結構包括α螺旋、伸展鏈、β轉角和無規卷曲，其中，鐵皮石斛STM蛋白的α螺旋占比為28.62%～33.76%，伸展鏈占比為11.68%～14.70%，β轉角占比為4.09%～4.78%，無規卷曲占比為49.56%～55.34%。

2.4 鐵皮石斛STM家族蛋白結構分析

對4個DoSTM蛋白進行多序列比對 （圖4），結果顯示DoSTM1-2蛋白序列同源性較高。DoSTM蛋白的保守基序分析結果表明4個DoSTM蛋白均有SBP保守結構域，而DoSTM1/3還同時包含Ank_2 superfamily，DoSTM2則還包含ANKYR （圖5）。同源的DoSTM1與DoSTM2含有motif 1-10，而DoSTM3與其相比缺少motif 7/10，DoSTM4不僅缺少motif 7/10，還缺少motif 3/4 （圖5）。表明4個DoSTM的蛋白結構并不高度保守。

2.5 鐵皮石斛STM基因結構及順式作用元件分析

DoSTM基因結構分析如圖6所示，發現4個DoSTM均有10個編碼區（由于gff3未注釋UTR，故未標識非編碼區）。順式作用元件分析發現4個DoSTM中均有光響應區和光響應元件，其中DoSTM1-3共同包含茉莉酸甲酯響應區，而防御應急響應只在DoSTM2/4中具備，除此之外DoSTM4還含有生長素響應元件（圖7）。而DoSTM1則可以對脫落酸作出響應，DoSTM3作為包含順式作用元件最多的STM蛋白，它還可以對赤霉素、水楊酸、生長素及低溫作出響應。

2.6 鐵皮石斛STM的表達分析

2.6.1 鐵皮石斛STM在根莖葉中的表達情況

我們對DoSTM在根莖葉3個不同器官的相對表達水平進行了分析 （圖8）。本研究發現，DoSTM在根莖葉中均有表達，DoSTM2在葉中的相對表達量顯著降低，而在莖中的表達水平則無明顯差異，DoSTM1/3/4的相對表達水平均無明顯差異，DoSTM1在莖和葉中的表達量相差無幾，但略高于根，而DoSTM3-4則在葉中的相對表達水平高于莖，且都低于根。

2.6.2 鐵皮石斛STM在脅迫處理下的表達情況 鐵皮石斛多生長在懸崖峭壁，會受到多種非生物脅迫，STM轉錄因子也有被報道參與多種抗逆反應 （王楠等，2016），故本研究進一步分析了DoSTM在不同脅迫條件下的表達情況 （圖9）。結果表明，DoSTM1在4 ℃低溫、40 ℃高溫和10% PEG脅迫處理下的相對表達水平低于對照組，而在ABA脅迫處理下的相對表達水平無顯著差異，但NaCl脅迫處理下，表達量略有降低；DoSTM2在4 ℃低溫和40 ℃高溫脅迫處理下的相對表達水平與對照組相比顯著降低，在脫落酸、NaCl、10%PEG脅迫處理下無明顯差異；DoSTM3在NaCl、4 ℃低溫和40 ℃高溫脅迫處理下的相對表達水平與對照組相比顯著降低，在脫落酸和10%PEG脅迫處理下與對照組相比稍有差異；與DoSTM3相似的是，DoSTM4在4 ℃低溫和40 ℃高溫脅迫處理下有顯著變化，在脫落酸脅迫處理下也發生顯著變化，但在NaCl脅迫處理下并無明顯差異。

3 討論與結論

本研究從鐵皮石斛基因組上鑒定出4個STM蛋白序列，對4個STM編碼的蛋白進行生物信息學分析。結果表明，4個DoSTM蛋白均為親水蛋白質；DoSTM1/3/4的等電點均小于7，DoSTM2則大于7，這一點與大部分STM蛋白家族成員的理論等電點大于7有出入 （張曉紅等，2016；劉闖等，2017；祁香寧等，2018）。SPL基因家族蛋白含有1個高度保守的SBP-BOX結構域，它是SPL蛋白和DNA分子特異性結合所必需的。這與我們在保守結構域預測時的發現一致。

李豆等 （2021）將白樺BpSPL6基因啟動子驅動GUS基因在轉基因擬南芥營養生長期的根尖及根的其他部位表達，發現在營養生長時期其在根部的表達也隨植物的生長逐漸增加，與前人研究一致，故他推測BpSPL6基因可能在植物的根發育過程中起作用。這與我們測得DoSTM2-4在根中的相對表達水平略高一致，推測DoSTM可能參與根的發育。

激素參與了植物生長發育的各個方面，已有多項研究表明SPL基因參與植物的激素響應過程。對白樺BpSPL6基因啟動子的順式作用元件分析表明 （李豆等，2021），其啟動子區含有10種激素響應元件 （生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸等）。這與我們得到的DoSTM順式作用元件分析結果類似，并且與在脫落酸脅迫條件下DoSTM3-4的相對表達水平發生顯著變化一致。利用RNA-seq研究發現擬南芥SPL10對茉莉酸、水楊酸和生長素等激素響應過程有廣泛影響。AtSPL10通過調節生長素的生物合成抑制根的再生 （Ye et al.， 2020）。赤霉素通過調節莖分生組織中的AtSPL3-5基因促進開花 （Galvo et al.， 2012）。在DoSTM啟動子上也發現了多種激素響應元件，故推測DoSTM可能參與多種激素響應。

大量研究表明SPL基因能夠響應低溫、高溫等非生物脅迫的信號。如Stief等 （2014）發現在高溫條件下，SPL2/9/11基因被miR156-f和miR156-h調控使其表達降低，進而延長植物對高溫脅迫的耐受性。除高溫條件外，葡萄對低溫條件也較敏感，在低溫條件下 （5 ℃），體內的VvSBP3和VvSBP5表達均被上調，而VvSBP4和VvSBP7表達明顯被下調，表明VvSBP3和VvSBP5參與葡萄的低溫脅迫反應 （吳艷等，2019）。這與DoSTM1-4在低溫、高溫脅迫條件下的相對表達量發生顯著變化一致。

對白樺BpSPL6轉基因擬南芥進行了NaCl和PEG脅迫實驗，發現受到脅迫后，其表達量有下降（李豆等，2021），與我們觀測到的在PEG脅迫條件下，DoSTM的相對表達水平顯著下調一致，推測DoSTM很可能參與植物的干旱脅迫響應。崔揚等 （2019）發現玉米遭受干旱脅迫時，ZmSPL16在根中的表達量顯著上調，這與DoSTM4結果一致，但與DoSTM1/3不一致，具體原因有待進一步研究。

本研究在鐵皮石斛全基因組水平鑒定出4個STM，生物信息學分析顯示他們均為親水蛋白，大部分定位在細胞核，都具有高度保守的SBP結構域以及與激素響應有關的順式作用元件。表達分析顯示他們在根中的表達量略高于莖和葉，脅迫分析顯示其在低溫、高溫及干旱脅迫下相對表達水平顯著變化，且部分DoSTM可以對脫落酸作出響應。以上研究結果為進一步研究DoSTM轉錄因子的生物學功能奠定了基礎。

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（責任編輯 周翠鳴）

收稿日期：? 2022-01-02

基金項目：? 國家自然科學基金（31900164）； 中央高?；究蒲袠I務費（2682021CX121）； 西南交大個性化實驗項目（GX2021160027）。

第一作者： 楊樂（1997-），碩士，主要從事植物生長發育與次生代謝研究，（E-mail）2295402195@qq.com。

*通信作者：? 王萬軍，博士，教授，主要從事植物生長發育與次生代謝研究，（E-mail） wanjunwang@home.swjtu.edu.cn。