lncRNA 調控鼻咽癌轉移過程及中藥干預的研究進展*

郭利培 張文青 何迎春， 田道法 王賢文

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是發生在鼻咽部黏膜的頭頸部惡性腫瘤之一，發病有明顯的地域傾向和種族差異，70%以上的新發病例來自東亞和東南亞地區,特別是在中國，每年新發病率占全球新病例的47.7%[1]。鼻咽癌是由遺傳易感性、EB病毒（epstein-barr virus, EBV）感染和其他環境危險因素引起的疾病，發病是一個多階段、多因素相互作用的過程，其發生發展涉及復雜的生物學機制過程，臨床特征包括高侵襲性，區域淋巴結和遠隔器官轉移率高。包括鼻咽癌在內，90%以上的腫瘤患者并不是由于原發性腫瘤進展導致的死亡，而是由于腫瘤發生了轉移[2]，一旦腫瘤轉移，治療上的難度就會大大提升，患者的生存率也會隨之下降。腫瘤轉移是腫瘤從原發部位脫落，侵襲到細胞外基質（extracellular matrix, ECM），進入到循環系統，穿透基底膜,漫潤周邊組織，擴散到體內較遠位置定植形成轉移瘤的變化過程，包括癌細胞上皮間質轉化（EMT），細胞遷移，抵抗凋亡和血管生成幾個步驟[3]。腫瘤轉移是鼻咽癌治療失敗的重要原因，也是患者預后的重要因素。因此，阻止原發性腫瘤的轉移是有效治愈鼻咽癌的關鍵所在。臨床上，鼻咽癌對放射療法敏感性較高，放射治療是目前公認的治療鼻咽癌有效的手段[4]，隨著調強放療在鼻咽癌中廣泛應用, 鼻咽癌的局部控制率和總生存率得到了顯著的提高, 但放射療法的副作用仍然是困擾鼻咽癌患者生活質量及治療進程的一大難題。中藥治療對鼻咽癌放化療具有協同效果[5]，能夠明顯降低患者術后不良反應，由于其具有多靶點、多效應、且毒副作用低等優點，已經成為鼻咽癌綜合治療中不可或缺的一部分。隨著高通量測序技術和微陣列技術的迅猛發展，最新的研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在癌癥轉移中起重要作用[6]。許多基因調節的異常改變都有lncRNA 的異常表達，而腫瘤的轉移和復發也涉及了多種基因的改變，這與lncRNA 有直接相關關系。因此研究lncRNA 異常表達的分子機制和以lncRNA 為靶點的中醫藥治療腫瘤的機制或許能夠為早期預測腫瘤轉移和利用基因靶向治療腫瘤以及開發新藥提供新的方向。

1 長鏈非編碼RNA 的分類和功能

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs, lnc-RNAs）[7]是一類轉錄本長度大于200個核苷酸，多數lncRNAs 由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄生成，然后被剪接，多聚腺苷酸化和5＇加帽而成熟，與DNA 不同的是，lncRNA 沒有完整的開放閱讀框，所以不具有蛋白編碼功能。大部分LncRNA 具有高度保守的近端啟動子序列，外顯子序列，內含子序列或二級RNA 結構，具有類型多、數量多、作用模式多的特點，主要分布于細胞核內，少量存在于細胞質中[8]。最初LncRNA 由于RNA 聚合酶保真度低，被認為是偽造的轉錄噪聲，近年來，研究發現，LncRNA 在整個真核基因組中普遍轉錄，越來越多的證據表明沒有蛋白質編碼能力的RNA 分子在多種生物學功能中起著重要的作用，它不僅是DNA 和蛋白質之間的中介樞紐，而且還在多種層面調控基因的表達水平。根據其與鄰近蛋白編碼基因的關系，lncRNA 可分為5 大類[9]，如圖1：①正義lncRNA：當與同一鏈上蛋白質編碼基因的一個或多個外顯子相重疊，且轉錄方向相同，稱為正義lncRNA；②反義lncRNA：當與另一條鏈（反義鏈）上的轉錄物外顯子相重疊時，則稱為反義lncRNA；③雙向lncRNA：當lncRNA 的表達起始位點與互補鏈上編碼轉錄物的表達起始點十分靠近（＜1000bp）時，稱為雙向lncRNA；⑤內含子 lncRNA：位于蛋白質編碼基因內含子區域，且與外顯子沒有重疊的轉錄本；⑤基因間lncRNA：lncRNA 位于2 個基因間的間隔中。lncRNA 的功能不僅僅局限于一套明確的功能，還可以調節多種活動，如信使RNA 降解、翻譯和蛋白質動力學，或作為RNA 誘餌或支架在表觀遺傳學調控、轉錄調控及轉錄后調控、翻譯及翻譯后水平的調控、以及調控miRNA 等多個層面調控基因表達。根據其在功能上執行的原型可分為四種[10]：①信號：lncRNA可以用作分子信號，顯示細胞類型特異性表達并對多種刺激作出反應；②誘餌：又被稱為“分子海綿”，這種原型的lncRNA 被轉錄，結合并滴定蛋白質靶標，使之不發揮任何功能；③導向：向導RNA 結合蛋白質，然后將核糖核蛋白復合物的定位引導至特定靶標-順式或者反式；④支架：lncRNA 將同時結合其多個效應伴侶，并通過這種方式將可能具有轉錄激活或抑制活性的效應子在時間和空間上結合在一起作為相關分子成分組裝的中心平臺，控制分子間相互作用和信號傳遞事件的特異性。腫瘤的轉移和復發涉及了多種基因的改變，近年來，越來越多的研究發現，lncRNA 與腫瘤發生發展具有密切聯系，lncRNA 的基因突變或者異?？梢酝ㄟ^直接或間接的方式影響EMT、細胞外基質（extracellular matrix, ECM）降解、微血管形成等過程[11-13]，介導腫瘤細胞增殖，遷移，侵襲以及凋亡。隨著人們漸漸了解到lncRNA 與腫瘤密切相關的重要性，未來對lncRNA 的深入研究將會打開預測診斷和治療相關疾病的新世界。

圖1 LncRNA 根據與鄰近蛋白編碼基因的關系分類

2 lncRNA 調控鼻咽癌轉移過程的機制

2.1 lncRNA 調控鼻咽癌EMT 的機制

上皮間充質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT）是指上皮細胞失去細胞極性和黏附性轉化為具有遷移侵襲功能的間充質細胞的一系列過程,EMT 使腫瘤細胞從相對靜止的局部增殖表型轉變為更活躍和易侵襲的細胞表型，這個生物學過程對腫瘤轉移非常重要[14]。在分子水平上，上皮細胞標志物如E 鈣黏蛋白（E-cadherin）和β 連環蛋白（βcatenin）等的下調，間充質細胞標記物如波形蛋白（Vimentin）、N 鈣黏蛋白（N-cadherin） 轉錄因子ZEB1、ZEB2 等的上調是觀測EMT 的重要指標[15]。LncRNA 調控鼻咽癌EMT 進程主要是通過執行第二種功能原型，即作為分子海綿結合并滴定蛋白質靶標，影響相關基因的表達。凋亡相關轉錄本LOC284837 是一種被命名為AATBC 的lncRNA，由于最先在膀胱癌中證實調控凋亡而被關注，Tang T 等[16]研究發現lncRNA AATBC 的表達與鼻咽癌進展也密切相關，沉默該基因的表達能夠有效降低鼻咽癌細胞的遷移侵襲能力，進一步研究發現AATBC是通過海綿作用作為一種ceRNA（competing endogenouse，又叫競爭性內源RNA）與miR-1237-3p 結合上調橋粒相關蛋白pinin（PNN）的表達，PNN 與上皮-間充質轉化（EMT）激活因子ZEB1 相互作用，上調ZEB1 的表達以促進鼻咽癌細胞的EMT。肺腺相關轉錄本MALAT1[17]在多種惡性腫瘤中異常表達，研究發現，MALAT1 在鼻咽癌中可以通過與miR-124 結合作為內源性海綿，消除miR-124 誘導的對Capn4 的抑制，從而影響EMT 的進程。長鏈非編碼RNA ZFAS1（鋅指蛋白反義鏈1）定位于人類染色體20q13，是新發現的lncRNA，有報道其在乳腺癌中下調，但在胃癌、結直腸癌、肺癌、和膠質瘤中發生上調，Wang X 等[18]研究lncRNA ZFAS1 在鼻咽癌中的作用，發現lncRNA ZFAS1 在鼻咽癌中作為致癌基因通過PI3K/AKT 通路來促進細胞增殖和EMT 進程，抑制凋亡。RAS 相關蛋白1A（Rap1A）是RAS 癌基因家族小G 蛋白的一個成員，Rap1A 可與B-Raf相互作用，激活MAPK/ERK 通路，調節細胞內整合素的親和力和活性，從而影響細胞粘附。LINC00460作為一種致癌基因在結直腸癌、胃癌、肺癌中高表達，研究發現[19]LINC00460 作為靶向miR30-3ps 的競爭性內源性RNA（ceRNA），調節Rap1A 的表達從而促進鼻咽癌細胞遷移、侵襲和EMT。EMT 過程需要大量的蛋白質翻譯和能量，轉化生長因子TGF-β1 等是一種多功能細胞因子[20]，在腫瘤細胞增殖、生成轉移過程中發揮重要的調節作用，Yang J[21]研究發現TGF-β1 在鼻咽癌CNE1 細胞中可以成功誘導EMT，并通過基因測序鑒定出在此過程中多種表達異常的基因，選出一條上調最顯著的轉錄本lnc-PNRC2-1 研究其在EMT 中的作用，發現lnc-PNRC2-1 的表達增加了其反義基因MYOM3 的表達，減少了EMT 標記的表達，但不能完全消除tgfb1 誘導的EMT，tgf-b1 誘導的EMT 可以通過抑制lnc-PNRC2-1 的表達來緩解。

2.2 lncRNA 調控鼻咽癌ECM 的機制

細胞外基質（extracellular matrix, ECM）是由蛋白質（膠原家族最豐富）、糖胺聚糖（如硫酸軟骨素、硫酸肝素和透明質酸）、蛋白聚糖（如透明質酸、聚集質、異黃酮和核心蛋白聚糖）和ECM 重塑酶（如ADAM、ADAMTS 和組織蛋白酶）組成的異質結構，不同器官間的組成、比例和生化修飾都很獨特[22]。異常的ECM 動態是癌癥的一個標志，在腫瘤發生和轉移中，ECM 調節和重塑至關重要[23]。近年來的研究表明，許多lncRNAs 在ECM 組分修飾相關的紊亂中發生異常改變，參與基因表達調控的一些層面。ECM 元件組成和配置的變化可以在表觀遺傳上影響細胞表型，lncRNA LINC01614 在原發性乳腺癌和乳腺癌細胞系中高表達，Vishnubalaji R 等[24]發現小分子抑制轉化生長因子β（TGFβ，SB-431542）或局灶黏附激酶（FAK, PF-573228）能夠通過TGF-β1和ECM 網絡抵消LINC01614 的表達。另外，ECM 可以通過與整合素家族在細胞膜上形成局部粘連來指導一系列功能，腫瘤上皮細胞經常大量分泌laminin-332（LAMA3、LAMB3 和LAMC2 編碼），不斷表達整合素α6β4 （ITGA6 和ITGB4 編碼）。laminin-332 是一種重要的ECM 分子，也是整合素α6β4 的主要配體[25]。連接后，整合素通路通過局灶粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）的磷酸化被激活，誘導下游信號通路。lncRNA CASC9 在許多癌癥中被證明是失調，Liang 等[26]研究發現，CASC9 在食管鱗癌組織中表達顯著上調，CASC9 與ECM-整合素相互作用影響相關的基因表達，證明整合素上游誘導劑LAMC2 上調能夠促進食管鱗癌轉移，CASC9 通過與核內轉錄共激活因子creb 結合蛋白（CBP）結合相互作用上調LAMC2 的表達，使整合素通路下游效應子（FAK、PI3K 和Akt）磷酸化，隨后激活FAK-PI3K/Akt 信號通路促進轉移?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）能夠降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤細胞浸潤轉移中的作用日益受到重視，lncRNA ENST00000412010 位于9 號染色體上，在鼻咽癌中異常表達，Cheng 等[27]沉默鼻咽癌中的lncRNA-ENST00000412010，基質金屬蛋白酶-7（MMP-7） 和周期蛋白依賴性激酶4 抑制劑B（CDKN2B）的mRNA 表達顯著下調，鼻咽癌細胞存活能力下降，證明lncRNA ENST000 00412010可能通過調節細胞增殖和ECM 在鼻咽癌的發生過程中發揮作用。HOX 反義基因間RNA（HOTAIR）編碼自染色體12q13.1315 上的HOXC 基因座，HOTAIR 具有2158 個核苷酸，通過修飾染色質結構在基因調控中發揮重要作用[28]，在結直腸癌、宮頸癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤的發生和轉移中都有參與[29]。肪酸合酶（fatty acid synthase, FASN）是一種多功能酶，以NADPH 依賴的方式催化棕櫚酸酯的合成，在腫瘤細胞中，脂類的功能需求增加，如膜生物合成、蛋白質修飾和信號分子，所以腫瘤細胞比正常細胞更加依賴FANS 催化的棕櫚酸酯合成，Ma 等[30]發現FASN 的表達與HOTAIR 呈正相關，并且下調HOTAIR 可以通過降低MMP-9 和p21 蛋白的表達水平導致鼻咽癌細胞FASN 的下調，從而抑制細胞增殖和侵襲，影響鼻咽癌ECM。

2.3 lncRNA 調控鼻咽癌血管形成的機制

腫瘤發生轉移侵襲與微血管的生成密切相關[31]，隨著原位腫瘤細胞的不斷增殖, 腫瘤組織開始建立起自己的血管網, 因為新生的血管內皮和基底膜有缺陷,腫瘤細胞易穿越基底膜屏障進入血液循環,進入循環系統后,它們通過形成同聚物或與白細胞、血小板形成異聚合物, 留駐在遠端血流緩慢的毛細血管網處,進而粘附微血管內皮并誘導內皮繃解，完成遠端擴散和轉移[32]。VEGF 是促進腫瘤血管新生和生長的重要因子[33]，它能夠促進血管形成，增加血管的通透性，介導細胞的遷移和浸潤。剪接因子絲氨酸/精氨酸重復基質蛋白2-選擇性剪接（lncRNA SRRM2 AS）肌凝蛋白輕鏈激酶（MYLK）主要功能是磷酸化肌球蛋白輕鏈Thr18 和Ser19，環磷酸鳥苷（cGMP）依賴和cGMP 獨立的途徑可以誘導MYLKA的激活，cGMP 為第二信使分子，可通過蛋白激酶G（PKG），PKG 是cGMP 信號轉導的重要下游調控因子，Chen 等[34]研究發現lncRNA SRRM2 AS 可以通過調節MYLK-介導的cGMP PKG 信號通路來參與NPC 增殖、分化和血管生成。Forkhead box C1（FOXC1）是Fox 轉錄因子家族的成員，在多種惡性腫瘤中過表達[35-37]，參與腫瘤生物學過程。Xu 等[38]發現lncRNA FOXCUT 可以調控FOXC1 mRNA 水平，FOXCUT 沉默后MMP7、MMP9、VEGF-A 和βcatenin 的表達均降低，鼻咽癌細胞增殖遷移水平顯著下降，推測FOXCUT 通過靶向FOXC1 參與調控鼻咽癌EMT 進展和腫瘤血管生成過程。LncRNA HOTAIR 最初在乳腺癌中發現[39]，HOTAIR 基因介導了多種腫瘤發生和轉移，萄糖調節蛋白78（GRP78）又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白（BiP），屬于熱休克蛋白70（HSP70）家族，GRP78 與各種腫瘤類型的進展高度相關[40，41]。Fu 等[42]研究HOTAIR 基因敲除直接抑制VEGFA 轉錄激活，并通過下調GRP78 的表達降低VEGFA 和Ang2 的表達。確定了HOTAIR 是通過直接促進VEGFA 轉錄以及通過上調GRP78 表達激活VEGFA 和Ang2 表達來介導腫瘤發生和血管生成的?？鼓[瘤的血管形成已成為現代腫瘤治療學研究的熱點，目前為止，與lncRNA 介導血管生成機制影響鼻咽癌進展過程的研究還為數不多，了解lncRNA 與血管生成具體的分子機制有助于靶向抗鼻咽癌藥物的研發，隨著臨床研究的進步，相信lncRNA 的演技在抗血管生成中發揮重要的科研價值。

3 以lncRNA 為靶點中藥防治鼻咽癌

中藥是來源于自然界中的天然藥物, 具有毒副作用低，有效成分復雜，治療作用廣泛等特點，隨著中藥藥理研究的不斷不深入，中醫藥逐漸被大家認可接受。研究表明，中藥可以通過調控腫瘤相關LncRNA 直接或間接地發揮抗腫瘤作用[43]，人源基因LncRNA TUC.338 由克隆多聚胞咤啶結合蛋白2基因獨立轉錄后形成的轉錄片段克隆而來，位于12號染色體上，Yu 等[44]研究發現LncRNA TUC.338 在胃癌組織中表達水平高于癌旁，通過實驗證明敲低LncRNA TUC.338 能夠抑制胃癌細胞增殖轉移，同時利用半夏瀉心湯干預后發現半夏瀉心湯能夠抑制該基因的表達，于是推測半夏瀉心湯的作用機制可能是與它下調胃癌細胞中Lnc RNA TUC.338 的表達相關。益氣除痰方是廣州中醫藥大學第一附屬醫院治療非小細胞肺癌的經驗方，臨床上能夠明顯改善患者生活質量，Jiang 等[45]研究發現益氣除痰方抑制肺癌細胞侵襲轉移的機制可能是通過下調MALAT-1，抑制Smad2/3 磷酸化,從而抑制肺癌細胞發生上皮間質轉化的進程。姜黃素是在中藥姜黃、莪術中提取的有效單體成分，它能調節多種信號分子參與藥理作用，lncRNA AK294004 是通過基因芯片篩選出的在鼻咽癌中顯著上調的差異表達基因，Fan 等[46]通過研究證實姜黃素調控能夠調控lncRNA AK294004 靶向逆轉細胞周期蛋白CCND1 實現放射增敏。黃芩素是中藥黃芩中的主要成分，Yu 等[47]研究發現在鼻咽癌中黃芩素可通過調控MAPK 及p53 信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導其凋亡，此外，還可通過下調MMP1、MMP2、MMP7 及MMP 9mRNA 的表達抑制鼻咽癌細胞侵襲和遷移，但其具體調控機制尚未闡明。目前，以lncRNA 為靶點的中藥治療鼻咽癌的研究目前尚還處于初步階段，但隨著研究者們對中藥及lncRNA 的關注，相信在將來一定能夠探索出其具體分子機制。

4 前景與展望

鼻咽癌對放療的敏感度較高，目前，調強放療在鼻咽癌的治療上已經廣泛應用，鼻咽癌的治療取得了一大進步，雖然鼻咽癌的治療已經有了進展，但面對鼻咽癌轉移和復發仍然是個棘手的問題。中藥作為一-種天然藥物，具有多靶點、多效應、副作用低等特點，在臨床上能夠明顯降低患者術后不良反應，并且中藥可以在多層次、多方面領域發揮藥理作用。隨著微陣列技術和高通量測序應用的迅猛發展，越來越多的研究證明LncRNA 在多種腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，這讓科研人員們看到了治療腫瘤轉移和復發的新希望。但lncRNA 分子結構復雜，在腫瘤轉移中的具體分子機制還有待探索，以lncRNA 為靶點中藥抗鼻咽癌的研究更是剛剛起步。本篇綜述概括了lncRNA 在EMT 過程、細胞外基質降解、血管生成部分中如何調控基因的表達來參與鼻咽癌細胞生長和轉移，以及以lncRNA為靶點中藥抗鼻咽癌的研究，展望利用基因靶向治療惡性腫瘤是一種很有前景治療策略，但其具體的開發靶向藥物針對性治療腫瘤還將是一個漫長的過程。