深海噬菌體BVE2內溶素的重組表達及其活性研究

張天佑,陳 源,余美舜,張蒙輝,3,金 敏,曾潤穎*

(1.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋生物遺傳資源重點實驗室,福建 廈門 361005;2.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋生物資源開發利用工程技術創新中心,福建 廈門361005;3.先進制造學院,福州大學,福建 福州362200)

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和坎氏弧菌(V.campbellii)等弧菌廣泛地存在于河口和海洋等生態環境中,是我國乃至世界范圍內導致養殖水產品死亡和引起人類腸道疾病的主要病原菌[1-3]。因其較強的適應能力和抗逆性,弧菌成為海洋環境中的優勢種群,經常作為致病菌導致疾病的暴發與流行。據不完全統計,我國每年因弧菌而導致的貝類病害造成的直接經濟損失就可高達20～30億元,其中以副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌、創傷弧菌(V.vulnificus)和哈維氏弧菌(V.harveyi)等弧菌為代表的高致病性耐藥性弧菌為主[4];在對蝦養殖中,V.harveyi、V.alginolyticus、V.parahaemolyticus等弧菌往往可以引起對蝦早期死亡綜合癥、白便、腸炎、紅體、爛鰓、黃腿,嚴重影響對蝦的健康養殖[5];同時,近年來,由于V.parahaemolyticus、V.alginolyticus感染導致的腸胃炎病例呈上升趨勢。以我國江陰市為例,2006—2010年間由弧菌引起的食源性疾病占細菌性食物中毒事件的首位,約為38.71%,對人類的身體健康產生了一定的影響[6]。與此同時,自抗生素發明以來,其高效和快速滅菌的特性使其迅速成為人們依賴的殺滅細菌方法,但隨著抗生素的廣泛使用,多種新型耐藥細菌迅速出現,傳統的抗生素已經不能有效的殺滅細菌[7]。然而新型抗生素的研究發展速度緩慢,因此開發新型的抗菌劑迫在眉睫[8-9]。

內溶素(Lysin)是一類由噬菌體編碼的酶,可以在噬菌體裂解周期的最后階段降解細菌細胞壁中的肽聚糖結構,使細菌破裂死亡并釋放子代噬菌體[10]。由于內溶素具有高的宿主特異性且不會引起細菌的耐藥性,使其已成為控制細菌的新策略,并且得到了越來越多的關注[11-14]。內溶素對革蘭氏陽性菌的抑制作用較好,因為外部添加的內溶素可以直接作用于細胞壁上的肽聚糖并使之降解[15],而革蘭氏陰性菌通常對外源性內溶素作用不敏感,因為其外膜可以作為物理屏障阻擋內溶素[16-17]。

本研究中,我們對西南印度洋沉積物樣品中的噬菌體BVE2進行了全基因組測序[18],從中篩選得到噬菌體BVE2的內溶素基因Lysin132,并進行了進一步的的生物信息學分析,成功克隆表達了BVE2內溶素基因Lysin132,并純化得到了重組BVE2 Lysin132,抑菌實驗結果表明其對V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi等弧菌具有較好的抑制效果。這些結果將為重組BVE2 Lysin132用作食品保鮮、水產養殖、醫藥等領域的新型抑菌劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和表達系統

噬菌體BVE2分離自西南印度洋深海沉積物,宿主為Bacillussp.E171,通過基因組分析表明,噬菌體BVE2屬于Caudovirales目、Siphoviridae科的新成員[18]。用于抑菌實驗的菌株(V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.plantisponsor、V.diazotrophicus)均為實驗室在前期工作中分離保藏。原核表達載體pEASY-Blunt E2 Expression Vector和表達宿主EscherichiacoliBL21(DE3)菌株購自TransGen Biotech公司。

1.1.2 酶、試劑和試劑盒

2×Phanta Max Buffer、dNTP Mix (10 mmol/L)、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、PCR產物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、Ni2+柱His-蛋白純化試劑盒為Thermo公司產品。異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺為索萊寶公司產品,其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 培養基及培養條件

表達宿主E.coliBL21(DE3)使用LB培養基(每1 L液體培養基包含10 g胰蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母粉;固體培養基另加15 g/L的瓊脂),在37 ℃以200 r/min振蕩培養。Bacillussp.E171同樣使用LB培養基,在30 ℃以200 r/min振蕩培養。V.alginolyticus、V.campbellii、V.ziniensis使用2216E培養基(每1 L液體培養基包含2 g酵母粉、10 g蛋白胨;固體培養基另加15 g/L的瓊脂),在30 ℃以200 r/min振蕩培養。其他抑菌實驗相關菌株使用TCBS培養基(每1 L液體培養基包含5 g酵母粉、10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、10 g檸檬酸鈉、10 g硫代硫酸鈉、3 g膽酸鈉、5 g牛膽汁粉、20 g蔗糖、1 g檸檬酸鐵、0.04 g溴麝香草酚藍、0.04 g麝香草酚藍;固體培養基另加15 g/L的瓊脂),在30 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 BVE2內溶素基因的PCR擴增

根據BVE2基因組中的內溶素序列設計了一對PCR擴增引物：正向引物為5′-GAAATTCAAAAAA AATTAGTTAATCCAAGTAAGTATGGTAC-3′;反向引物為5′-TTTAACTTCATACCACCAACCTTTACGG-3′。以Bacillussp.E171和BVE2共培養的菌液為模板進行內溶素基因的擴增,50 μL PCR反應體系為：2×Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、正向引物(10 μmol/L) 1 μL、反向引物(10 μmol/L) 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 20 μL。PCR反應程序：為95 ℃預變性180 s,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,變性、退火、延伸重復30個循環,72 ℃徹底延伸300 s。待PCR反應完成后,用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物。

1.2.2 BVE2內溶素表達菌株的構建

擴增產物由PCR產物純化試劑盒進行純化后回收,與pEASY-Blunt E2 Expression Vector輕輕混合,室溫25 ℃反應5 min,反應結束后將產物置于冰上;通過化學轉化法將連接產物導入表達宿主E.coliBL21(DE3)中,隨后將重組菌株涂布于LB瓊脂固體平板上(含100 μg/mL的氨芐青霉素),37 ℃培養12 h。提取重組質粒,用目的基因的正向引物和T7 Terminator Primer鑒定陽性克隆的連接方向,選擇連接正確的陽性克隆進行測序驗證。

1.2.3 重組BVE2 Lysin132的誘導表達

挑選測序正確的表達宿主E.coliBL21(DE3)單菌落至5 mL液體LB(含100 μg/mL的氨芐青霉素)培養基試管中,37 ℃,200 r/min培養2 h。再按1%的比例轉接至50 mL液體LB(含100 μg/mL的氨芐青霉素)培養基中,37 ℃振蕩培養2～3 h至菌液OD600=0.8,向50 mL培養基中加入0.1 mol/L IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,在16 ℃,200 r/min下繼續振蕩培養12 h后,以8 000 r/min離心20 min收集菌體,向菌體細胞中加入10 mL 磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),重懸后使用超聲破碎細胞儀(舜瑪SM-1500D,300 W)破碎細胞。破碎完成后,以10 000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清液用于重組BVE2 Lysin132蛋白的純化。

1.2.4 重組BVE2 Lysin132的純化

將上述收集獲得的上清液與Ni2+親和層析柱孵育結合30 min,采用清洗緩沖液(25 mmol/L咪唑溶于磷酸鹽緩沖液中,pH=7.4)在4 ℃下清洗多次后,用洗脫緩沖液(250 mmol/L咪唑溶于磷酸鹽緩沖液中,pH=7.4)洗脫獲得重組BVE2 Lysin132。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測洗脫的重組蛋白。

1.2.5 重組BVE2 Lysin132的酶活性測定

按照《溶菌酶活性檢測方法》[19]測定重組BVE2 Lysin132的活性。采用LB液體培養基培養溶壁微球菌標準菌株(Micrococcuslysodeikticus,CGMCC 1.634,購自北京北納創聯生物技術研究院),將培養至對數期的菌液離心(10 000 r/min,20 min)收集菌體,用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌菌體至無培養基狀態,后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將菌液OD450調節至1.300,在反應管中加入2.5 mL菌懸液,加入0.5 mL內溶素,記錄反應1 min時OD450的讀數A1,反應2 min時的讀數A2,溶菌酶活力計算公式為：

(1)

式(1)中：I為內溶素的酶活力,E為檢測用內溶素的質量。內溶素的酶活力定義為：在25 ℃,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中,以溶壁微球菌為底物,每分鐘使OD450下降0.001時所需的酶量。

1.2.6 重組BVE2 Lysin132酶學性質分析

酶學性質分析主要包括最適溫度、最適pH值、pH穩定性、熱穩定性、金屬離子以及抑制劑與螯合劑對酶活性的影響、抑菌實驗等幾個方面。

①最適溫度。以OD450=1.300的溶壁微球菌為底物,設置不同溫度梯度：10、20、30、40、50、60、70 ℃,在最適pH下測定不同反應溫度下的酶活力,將酶活力最高值定義為100%,計算其余的相對酶活力,確定最適酶反應溫度,每組樣品均設置3個平行對照。

②最適pH值。配制一系列不同pH值的緩沖液：檸檬酸-檸檬酸鈉(pH值分別為3.01、4.04、5.02、6.05、7.09),Tris-HCl(pH值分別為7.04、8.06、9.08),NaOH-Gly(pH值分別為9.02、10.08、11.03),分別用以上緩沖液配制OD450=1.300的溶壁微球菌菌液,在最適溫度下測定不同pH條件下的酶活力,將酶活力最高值定義為100%,計算其余的相對酶活力,確定酶最適pH值,每組樣品均設置3個平行對照。

③熱穩定性。以OD450=1.300的溶壁微球菌為底物,將酶分別置于不同溫度的水浴鍋(10～60 ℃)中孵育10、20、30、60、90 min,在最適pH值下測定殘余酶活力,將酶活力最高值定義為100%,計算其余的相對酶活力,每組樣品均設置3個平行對照。

④pH穩定性。以OD450=1.300的溶壁微球菌為底物,將酶分別置于不同pH值的緩沖液(pH 3.0～11.0)中耐受10、20、30、60、90 min,在最適溫度下測定殘余酶活力,將酶活力最高值定義為100%,計算其余的相對酶活力,每組樣品均設置3個平行對照。

⑤金屬離子對酶活性的影響。將不同金屬離子預先與酶在最適溫度和pH值條件下孵育10 min,以OD450=1.300的溶壁微球菌為底物,使金屬離子的反應終濃度分別為0.1、1.0、10.0 mmol/L。并以不加金屬離子的反應體系為對照,測定殘余酶活力。將不添加金屬離子時的酶活力定義為100%,計算其余的相對酶活力,每組樣品均設置3個平行對照。

⑥抑制劑和螯合劑對酶活性的影響。將EDTA、SDS、PMSF、Tween-20、DTT和Triton X-100預先與酶孵育10 min,以OD450=1.300的溶壁微球菌為底物,以不加酶抑制劑或螯合劑的反應體系為對照,在最適反應條件下測定殘余酶活力。將不加酶抑制劑或螯合劑時的酶活力定義為100%,計算其余的相對酶活力,每組樣品均設置3個平行對照。

⑦抑菌實驗(打孔法)。以市售的蛋清溶菌酶(滄州夏盛酶生物技術有限公司,2 000 U/mg)和微生物溶菌酶(滄州夏盛酶生物技術有限公司,3 000 U/mg)為對照,在相同酶濃度(2 mg/mL)下進行抑菌效果的比較。以V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.diazotrophicus等實驗室現有的弧菌為受試菌株,經活化后加入已冷卻至50 ℃左右的平板培養基中,混合均勻,傾注平板,待平板充分凝固后,以滅菌的打孔器在平板上均勻打孔,小心挑去培養基小塊做成圓孔,向孔中加入100 μL濃度為2 mg/mL的重組BVE2 Lysin132、蛋清溶菌酶和微生物溶菌酶,4 ℃預擴散2 h,37 ℃下恒溫培養12 h,以游標卡尺采用十字測量法測定抑菌圈直徑,以抑菌圈直徑表示抑菌圈的大小,每組實驗設置3個平行對照,最終統計結果均為重復3次取平均值所得。其中,增長率是指重組BVE2 Lysin132的抑菌圈直徑與微生物溶菌酶的抑菌圈直徑相比的增加量。

2 結果與討論

2.1 BVE2 內溶素基因的序列分析

根據基因預測的結果,從噬菌體BVE2的基因組中發現了一段全長702 bp,編碼噬菌體內溶素的開放閱讀框(ORF),命名該ORF為Lysin132。Lysin132所編碼的蛋白(BVE2 Lysin132)由234個氨基酸殘基組成,預計分子量為25.74 kDa;經BlastP比對后,發現GenBank中已有蛋白的氨基酸序列與BVE2內溶素氨基酸序列相似度較高,選取BlastP結果中與BVE2內溶素同源性最高的6條序列,與BVE2內溶素氨基酸序列進行多重氨基酸序列比對(圖1),結果發現BVE2 Lysin的氨基酸序列中存在著由His29、His129、Cys137、Tyr46、Lys135組成的酰胺酶催化活性位點,這些催化活性位點在不同的酰胺酶中具有高度的保守性,同時也是維持酰胺酶活性的必須序列,因此推測BVE2 Lysin是一種N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。

圖1 BVE2 Lysin132的保守序列分析Fig.1 Conserved sequence analysis of BVE2 Lysin132用于比對的6條氨基酸序列的GenBank登錄號為GCA_002605725.1、GCF_000916355.1、GCF_000008445.1、GCA_002951935.1、GCA_002617305.1、GCA_003368845.1;陰影部分代表N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶保守基序的氨基酸殘基。

根據BlastP的比對結果,選取與BVE2 Lysin132內溶素同源性較高的氨基酸序列,采用鄰接法構建系統發育樹(圖2),在進化樹上BVE2 Lysin132與Bacillusvirus Wbeta(gb | ABC40416.1)中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶聚為一類,表明BVE2 Lysin132是一種酰胺酶。

圖2 BVE2 Lysin132氨基酸序列的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of BVE2 Lysin132 based on amino acid sequence

2.2 重組BVE2 Lysin132的表達及純化

將Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,并構建E.coli-pEASY-Lysin132表達菌株。SDS-PAGE的結果顯示,經過IPTG誘導表達后,發酵液上清中出現一條分子量約為25 kDa的蛋白條帶(圖3,箭頭所示)與預測的重組BVE2 Lysin132分子量一致,表明基因Lysin132在大腸桿菌中成功得到了異源表達。含有重組蛋白的上清液經過Ni2+親和層析柱純化后得到了單一條帶的重組蛋白。

圖3 重組BVE2 Lysin132的誘導表達與純化Fig.3 Inducible expression and purification of recombinant BVE2 Lysin132泳道M為蛋白marker,泳道1為E. coli-pEASY-Lysin132未誘導總蛋白,泳道2為誘導后總蛋白,泳道3～7為順序洗脫的重組BVE2 Lysin132;箭頭指示位置為目標蛋白。

2.3 重組BVE2 Lysin132基本酶學性質分析

2.3.1 最適反應溫度

重組BVE2 Lysin132的最適反應溫度為30 ℃,在20～45 ℃范圍內具有50%以上的酶活力,在10 ℃左右仍然具有20%以上的酶活力,20 ℃左右則具有50%左右的酶活力(圖4),表現出一些低溫內溶素的特性,這可能與其來源于深海低溫環境有關。

圖4 重組BVE2 Lysin132的最適反應溫度Fig.4 Optimal reaction temperature of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.2 最適反應pH值

重組BVE2 Lysin132的最適反應pH為7.0,30 min內,當pH值在5.0～9.0時具有40%以上的酶活力(圖5),當pH值在6.0～8.0時則具有80%以上的酶活力,表明其有較寬的pH作用范圍。

圖5 重組BVE2 Lysin132的最適pH值Fig.5 Optimal pH value of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.3 熱穩定性

重組BVE2 Lysin132在10～40 ℃下孵育90 min以上仍能保持80%以上的酶活力,在50 ℃的水浴中孵育90 min則剩余70%左右的酶活力,在60 ℃水浴中孵育90 min仍剩余約40%的酶活力(圖6),說明其具有良好的耐高溫能力。

圖6 重組BVE2 Lysin132的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.4 pH穩定性

重組BVE2 Lysin132在pH值為6.0～8.0的緩沖液中相對較為穩定,孵育90 min仍保持75%左右的相對酶活力。但在強酸、強堿條件下均不穩定,總體而言,其對堿性條件的耐受性優于對酸性條件(圖7)。

圖7 重組BVE2 Lysin132的pH穩定性Fig.7 pH stability of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.5 金屬離子對酶活性的影響

從表1可以看出,重組BVE2 Lysin132的酶活力隨著Na+濃度的增高逐漸升高;Mg2+在0.1 mmol/L時對酶活力的促進作用要比10 mmol/L和1 mmol/L強一些,可見低濃度的Mg2+對酶活力有顯著的促進作用;K+對酶活力的促進作用與Zn2+類似,并不明顯;Ca2+對酶活力的促進作用在1 mmol/L時達到最高(143%左右),后續可進一步探究Ca2+對酶活力促進作用的機制;低濃度Mn2+、Ba2+對酶活力均有一定的促進作用;反之,Fe3+、Cd2+對酶活力的抑制作用都很明顯,且隨著濃度的增加抑制作用逐漸增強,在10 mmol/L時均可使酶完全失活。

表1 金屬離子對重組BVE2 Lysin132酶活力的影響Tab.1 Effects of metal ions on the activity of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.6 抑制劑和螯合劑對酶活性的影響

從圖8可以看出Tween-20、Tritonx-100、PMSF對重組BVE2 Lysin132具有強抑制作用,SDS、DTT有一定的抑制作用,EDTA有輕微的抑制作用。

圖8 抑制劑和螯合劑對重組BVE2 Lysin132酶活力的影響Fig.8 Effects of inhibitors and chelating agents on the activity of recombinant BVE2 Lysin1321為空白對照,2為0.1% Tween-20,3為0.1% Triton X-100,4為EDTA(1 mmol/L),5為SDS(1 mmol/L),6為PMSF(1 mmol/L),7為DTT(1 mmol/L)。

2.3.7 抑菌活性

以V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.plantisponsor、V.diazotrophicus等弧菌為指示菌,并與市售的蛋清溶菌酶和微生物溶菌酶在相同酶濃度(2 mg/mL)下進行抑菌效果的比較,結果如下(表2)。由于蛋清溶菌酶對弧菌的抑制作用并不明顯,我們重點比較了微生物溶菌酶與重組BVE2 Lysin132對不同弧菌抑菌效果的差異,結果表明,重組BVE2 Lysin132對除了V.diazotrophicus之外的受測弧菌的抑菌效果均明顯優于市售微生物溶菌酶。

表2 重組BVE2 Lysin132與蛋清溶菌酶、微生物溶菌酶對不同弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial activity of recombinant BVE2 Lysin132,egg white lysozyme and microbial lysozyme against different Vibrio

2.4 討論

雖然越來越多的深海微生物資源得到了勘探與挖掘,但目前關于深海噬菌體來源的資源研究仍然不多。重組BVE2 Lysin132的成功表達,表明深海噬菌體有可能會成為酶資源挖掘的一個重要來源。已報道的深海來源的噬菌體內溶素GVE2,其最適溫度為60 ℃,僅在40～80 ℃的溫度范圍內具有酶活性[20]。而我們的研究結果表明：重組BVE2 Lysin132的熱穩定性良好,在10～40 ℃的條件下孵育90 min后仍能保持80%以上的酶活力,具有低溫酶的一些特性,可能在食品保鮮、防腐等方面有一定的應用潛力。

由于絕大多數的革蘭氏陰性菌均具有一層外膜結構來保護其自身免受內溶素的影響,因此很多內溶素在發揮作用前需要先使用外膜透化劑來破壞細菌外膜的穩定性,進而才能達到溶解細菌的目的[11]。例如針對副溶血弧菌的內溶素Lysqdvp001在未經EDTA預處理時并不能有效抑制副溶血弧菌[21],而針對溶藻弧菌的內溶素cwlQ則需要與其HolA蛋白協同作用才能有效殺滅弧菌,單獨的內溶素cwlQ對溶藻弧菌并無抑制效果[22]。其他幾種增加革蘭氏陰性菌外膜滲透性的方法包括使用螯合劑EDTA、陽離子試劑或有機酸[23]、內溶素的N端連接疏水性肽等方法[24]。在本研究中,我們發現在不使用外膜透化劑或其他蛋白協同的情況下,重組BVE2 Lysin132仍然可以對部分革蘭氏陰性菌有一定的抑制效果,尤其是對Vibrioalginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.diazotrophicus等弧菌有較強的抑制作用。在同一酶濃度的條件下,與市售的微生物溶菌酶相比,抑菌效果最大提升了40%以上。鑒于弧菌在水產養殖,尤其是對蝦、貝類養殖中的危害,重組BVE2 Lysin132在水產養殖方面具有潛在的應用價值,且在實際應用中可以免去使用外膜透化劑,這可以縮小養殖成本,更好地保護水產養殖周圍的生態環境。

3 結論

BVE2是一株來源于西南印度洋沉積物中的新型噬菌體,對其基因組中關鍵蛋白的表達和功能分析表明BVE2的內溶素基因Lysin132是一種編碼N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的基因。酶學性質分析表明重組BVE2 Lysin132的最適反應溫度為30 ℃,且在10～50 ℃下孵育90 min,仍能保持70%左右的酶活力,具有良好的熱穩定性;最適pH為7.0,且具有較寬的pH作用范圍;Na+、Ca2+、Mg2+對其有明顯的激活作用,均可使酶活力顯著提高20%以上,Fe3+、Cd2+在10 mmol/L的濃度下均可使其完全失活,抑制作用明顯。抑菌實驗的結果證實,重組BVE2 Lysin132對Vibrioalginolyticus、V.campbellii、V.harveyi等弧菌的抑制效果顯著。這些結果表明,重組BVE2 Lysin132在食品保鮮,以及水產養殖中具有潛在的應用價值。