MALDI-TOF質譜技術對豬腸道菌群中攜帶mcr-1細菌的鑒定與聚類分型

高 蕓，軒慧勇，姚曉慧，魏建超，劉 珂，邵東華，邱亞峰，馬志永，李蓓蓓，夏利寧

（1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241）

隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥已經成為21世紀人類健康的最大威脅之一[1]。動物腸道菌群長期經受高水平的抗生素選擇性壓力，是耐藥性發生發展的重要場所和耐藥基因的貯藏庫，一些嚴重危害人類健康的耐藥基因，如質粒介導的多粘菌素耐藥基因mcr-1[2]、替加環素耐藥基因tet（X3/4）[3]以及利奈唑胺耐藥基因optrA[4]，在養殖動物腸道來源的細菌中不斷被發現和報道。然而，對于特定耐藥基因在動物腸道菌群中的發生發展和傳播擴散機制卻知之甚少。

細菌種屬鑒定以及親緣關系分析是耐藥流行病學研究的基礎。目前細菌的鑒定方法主要有生化反應試驗、16S rRNA測序比對和細菌特異基因檢測等，菌株同源性分析則多采用脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）、隨機多態性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）、多位點序列分型（multilocus sequence typing,MLST）、全基因組測序（whole genome sequencing,WGS）等分子生物學方法[5]。上述細菌鑒定及分子分型方法存在步驟繁瑣，操作過程耗時較長或儀器昂貴等缺點。

近年來發展起來的基質輔助激光解析飛行質譜（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）技術，通過檢測菌體蛋白質指紋圖譜實現對不同細菌屬、種的區分和鑒定[6]。與其他傳統的分子生物學技術相比，它的操作方法更簡單和快速。目前MALDITOF廣泛用于細菌鑒定，而基于MALDI-TOF的分型方法也在快速發展當中[7]。如Egli等[8]通過MALDITOF MS方法對產超廣譜β-內酰胺酶的大腸桿菌進行分型，結果顯示，使用MALDI-TOF MS的聚類樹狀圖與PFGE的分析非常相似。Ueda等[9]通過MALDITOF MS方法對24株臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌質譜分析顯示，蛋白質指紋圖譜成功用于分型，且分型結果與PFGE結果無差異。

本研究以豬腸道菌群為研究對象，以多粘菌素耐藥基因mcr-1為目的基因，獲取豬腸道菌群的mcr-1陽性菌株庫，在此基礎上，應用MALDI-TOF MS技術，對攜帶mcr-1菌株進行快速鑒定和親緣關系分析，為解析mcr-1基因在腸道菌群中的分布擴散特征和遏制耐藥菌的傳播提供科學依據和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品來源與細菌分離 2019年1月，從上海某屠宰場采集一頭肥豬的新鮮腸道內容物約1 g，將其置于冰盒內低溫運輸至實驗室。將上述糞便樣本稀釋至合適濃度，直接涂布于含有多粘菌素E（3 mg/L）+利奈唑胺（20 mg/L）+萬古霉素（20 mg/L）藥物的TSA固體培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取培養皿上所有單菌落，經二次純化和細菌增殖后，制成20%的甘油菌進行保種，于-80℃凍存備用。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptone Soya Agar,TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soya broth,TSB）購自上海少辛生物科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix、瓊脂糖、50× TAE和核酸染料均購自上海翊圣生物科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸基質液（CHCA）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；多粘菌素E、萬古霉素、利奈唑胺均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 DNA模板的制備 將多粘菌素耐藥菌株劃線接種于TSA固體培養基上，37℃培養16～24 h，刮取菌苔于50 μL TE中，100℃煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 ×g離心10 min，取上清液作DNA模板，-20℃保存備用。

1.4 耐藥基因mcr-1的檢測 根據相關參考文獻[10]由上海派森諾生物科技股份有限公司合成mcr-1耐藥基因引物，引物序列為F：5'-CGGTC AGTCCGTTTGTTC-3'；R：5'-CTTGGTCGGTC TGTAGGG-3'。反應體系（20 μL）為：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 菌株鑒定及分型

1.5.1 上樣前準備 將待測菌株接種于5%血平板，經37℃過夜培養。用無菌接種環挑取單個菌落均勻涂抹于靶板的樣本孔，滴加1 μL CHAC基質液覆蓋菌苔，質控大腸桿菌ATCC8739涂于靶板的質控孔，自然晾干后上機檢測。儀器參數為：激光強度47 Hz，質量范圍m/z：2～20 kDa，有效檢測范圍2～15 kDa，線性操作模式，激光點擊數為100。

1.5.2 MALDI-TOF MS菌株鑒定 在IVD模式下進行目標菌株數據采集，檢測結束后，通過Myla軟件查看鑒定結果。鑒定結果可信度判定標準為：＞99.00%表示鑒定結果極可靠，＞90.00%表示鑒定結果可靠，80.00%～90.00%為鑒定結果較可靠，有待進一步判別，其中＜80%的認為鑒定結果極不可靠。

1.5.3 MALDI-TOF MS聚類分析 在RUO模式下進行目標菌株數據采集，通過SARAMIS Target Manager軟件，在Results界面下選擇需要進行同源性分析的菌株，將蛋白指紋圖譜導入SARAMIS分類樹，用SARAMIS軟件自帶的TAXMONY功能模塊進行聚類分析。菌株親緣關系分析參照PFGE標準，以相似性≥80%作為同一克隆的劃分依據[11]。

2 結果

2.1mcr-1陽性菌株分離鑒定結果 本研究以同一豬腸道內容物樣本為研究對象，利用添加抗生素平板進行多粘菌素耐藥菌株的篩選和收集，共計獲得325株細菌。利用VITEK MS微生物檢測系統對上述325株細菌進行種屬鑒定。鑒定結果顯示，325株細菌包括70株大腸桿菌、19株肺炎克雷伯菌、47株放線桿菌、122株產氣巴斯德菌和67株奇異變形桿菌（表1）。據文獻報道，奇異變形桿菌對多粘菌素為天然耐藥[12]，因此本試驗分離的67株奇異變形桿菌未列入后續研究中。對上述除奇異變形桿菌外的其他菌株利用PCR進行mcr-1基因的篩查，共得到136株mcr-1陽性菌株，包括大腸桿菌70株、肺炎克雷伯菌19株和放線桿菌47株（圖1）。此外，122株多粘菌素耐藥產氣巴斯德菌均為mcr-1陰性，對其進行了其余mcr基因的檢測[13]，結果也均為陰性，提示可能存在其他對多粘菌素耐藥的機制。以上結果表明，多粘菌素耐藥基因mcr-1在動物腸道菌群中存在種屬水平的廣泛分布。

表1 細菌分離鑒定結果Table 1 Bacteria isolation and identification results

圖1 部分mcr-1陽性菌株基因檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR detection of mcr-1 gene

2.2 MALDI-TOF MS對mcr-1陽性菌株的分型

2.2.1mcr-1陽性大腸桿菌的分型 在RUO模式下，對70株mcr-1陽性大腸桿菌的蛋白指紋圖譜進行聚類分析（圖2），結果顯示，70株大腸桿菌相似度為65.0%～95.0%，可分為a～m共13個亞型。a亞型克隆群菌株數量最多，包含40株菌（占57.1%），是mcr-1攜帶大腸桿菌的優勢克隆菌株。而l型和m型菌株數最少，各為1株，其他亞型包含的菌株數為3～4株。豐富的克隆群提示mcr-1基因在豬腸道大腸桿菌菌群中同時存在克隆傳播和水平轉移。

圖2 70株大腸桿菌的MALDI-TOF-MS分型聚類圖Fig.2 Dendrogram based on MALDI-TOF-MS of the 70 mcr-1-positive E.coli isolates

2.2.2mcr-1陽性肺炎克雷伯菌的分型 運用RUO模式，對19株肺炎克雷伯菌的蛋白指紋圖譜進行同源性分析（圖3），結果顯示，19株肺炎克雷伯菌相似度為70.0%～90.0%，可分為a、b、c 3個亞型，其中有17株肺炎克雷伯菌屬于a亞型，占比89.5%。另外兩個亞型均只包含一個菌株。上述結果提示，mcr-1在豬腸道中肺炎克雷伯氏菌中以克隆傳播為主。

圖3 19株肺炎克雷伯菌的MALDI-TOF-MS分型聚類圖Fig.3 Dendrogram based on MALDI-TOF-MS of the 19 mcr-1-positive K.pneumoniae isolates

2.2.3mcr-1陽性放線桿菌的分型 在RUO模式下，對47株放線桿菌的蛋白指紋圖譜進行聚類分析（圖4）。結果顯示，47株放線桿菌的蛋白指紋圖譜的相似度均在80%以上，表明這些菌株均為同一克隆。

圖4 47株Actinobacillus sp.的MALDI-TOF-MS分型聚類圖Fig.4 Dendrogram based on MALDI-TOF-MS dendrogram of the 47 mcr-1-positive Actinobacillus sp.isolates

3 討論

多粘菌素被認為是治療多重耐藥腸桿菌以及其他革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”[14]，質粒介導的可水平轉移的多粘菌素耐藥基因mcr-1的發現嚴重威脅該藥的臨床應用。mcr-1在養殖動物源細菌中有極高的流行率。一項涵蓋1611株禽源大腸桿菌的研究表明，80年代之前幾乎不存在mcr-1基因，該基因的陽性率從2009年的5.2%上升至2014年的30%[15]。仝慧嫻等[14]調查了2016—2017年我國18省市豬源糞便中mcr-1的攜帶率，結果表明，我國豬糞便中mcr-1的攜帶率高達76.2%。腸道菌群存在細菌種類多、數量大和密度高的特點，為耐藥基因的轉移和擴散創造便利的環境條件，是耐藥菌生存和繁殖的理想場所。探明特定耐藥基因在腸道菌群中的分布模式和傳播擴散機制對于理解耐藥性的發生發展具有重要意義。

本研究以同一豬腸道樣品為研究對象，從中共獲得136株mcr-1陽性菌株，包括70株大腸桿菌、19株肺炎克雷伯菌和47株放線桿菌。研究結果顯示，多粘菌素耐藥菌中mcr-1攜帶率高，且可在不同種屬的細菌中分布。在本研究的mcr-1陽性菌株中，大腸桿菌的占比達到51.5%（70/136）。Chen等[16]分離鑒定出的54株豬源mcr-1陽性菌株，均屬于大腸桿菌；黃騰[17]報道的735株豬源粘菌素耐藥大腸桿菌中，有610株檢測到mcr-1基因，檢出率高達83.0%。上述結果均說明大腸桿菌是mcr-1基因的主要宿主。此外，本研究還檢測到47株攜帶mcr-1基因的放線桿菌屬細菌，這些菌株的蛋白指紋圖譜一致，說明它們是同一種屬的細菌。本實驗室的另一項研究對其中一株菌進行全基因組測序[18]，發現它是一種攜帶mcr-1基因的新型放線桿菌。進一步對該菌中mcr-1基因環境進行分析發現，該基因位于一個新的整合性接合元件（ICEAsp1）上，mcr-1與其他9個耐藥基因共同組成了一個多重耐藥基因簇。對mcr-1基因環境深入分析發現，其由一個復合轉座子Tn6330（ISApl1-mcr-1-pap2-ISApl1）攜帶，這種結構增加了mcr-1的可轉移性，有利于其在不同種屬的細菌間進行水平傳播。

本研究MALDI-TOF MS聚類分析顯示，大腸桿菌被分為13個亞型，肺炎克雷伯菌分為3個亞型，而放線桿菌均為同一克隆，同一種屬細菌分型的多樣性顯示出耐藥基因mcr-1在同一動物腸道菌群中既存在水平傳播也存在克隆傳播。目前，MALDI-TOF技術已被應用于多種常見細菌的分型檢測中，如趙貴明等[19]利用MALDI-TOF MS對克羅諾桿菌進行分型，在RUO模式下32株克羅諾桿菌可分為a～f共6種亞型，該方法豐富了現有的克羅諾桿菌分型方法；宗凱等[20]應用MALDI-TOF MS對采集的44株芽孢桿菌進行蛋白指紋圖譜及親緣關系分析，建立了蜂蜜中芽孢桿菌溯源的方法。目前PFGE是細菌分子分型的金標準[21]，通過獲得菌株的DNA指紋圖譜進行同源性分析，具有很高的辨析度，但該方法不能對細菌進行種屬鑒定，同時存在耗時長、儀器昂貴和成本高等缺點。而MALDI-TOF-MS通過收集蛋白質指紋圖譜，可以對細菌進行初步的分型研究，只需要簡單的樣品制備，就可以在短時間內獲得結果。目前已有多項研究通過該方法對常見細菌進行分型研究，也表明該方法具有較好的可靠性[7]。如Meng等[22]應用MALDI-TOF MS對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌和黏質沙雷菌進行分型，分型結果與MLST和全基因組測序具有較好的一致性；王耀等[23]應用MALDI-TOF MS方法建立單增李斯特氏菌數據庫，通過對數據庫中該菌的主要圖譜進行比對，構建系統進化樹，進而將37株單增李斯特菌分離株劃分為9個亞型，以此建立MALDI-TOF MS技術對單增李斯特菌的分型。

綜上，本研究利用MALDI-TOF MS技術對同一豬腸道菌群中分離的325株多粘菌素耐藥菌株進行鑒定，并對136株mcr-1陽性菌株進行同源性分析，結果表明mcr-1在豬腸道菌群中既存在水平傳播也存在克隆傳播?；贛ALDI-TOF MS的分型方法具有快速、高通量和分析成本低的優勢，可作為現有分子分型方法的補充，在細菌溯源和親緣關系分析中可起到重要作用。