紅帶錐蝽性別決定基因doublesex的克隆及表達分析

田蕓嘉，郭云海，張 儀，朱 丹，李元元，劉 琴

（中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所（國家熱帶病研究中心） 國家衛生健康委員會寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室 世界衛生組織熱帶病合作中心 國家級熱帶病國際聯合研究中心，上海 200025）

性別分化通常是由性別決定級聯通路上的關鍵基因、兩性差異表達基因、發育相關基因互作和調控。昆蟲的性別決定是由復雜的基因調控網絡控制的，盡管上游的初始信號和決定因子部分各物種之間并不保守，變異較大；但最下游都有保守的雙性基因（doublesex，dsx）。Dsx基因具有兩種特征性的結構域：N端保守的DNA結合結構域（DM結構域/OD1）以及C末端特異的二聚化結構域（OD2）[1]。Dsx基因最早在果蠅中被解析，它出現在從低等到高等不同動物的性別決定基因中[2]。Dsx基因的保守結構預示了它功能的保守性。最近的研究表明，dsx僅在需要細胞通過功能或形態表現其性別特征時才表達，這種dsx表達的時空調控機制在已研究的所有節肢動物物種（如金小蜂、褐飛虱等）中均有建立，因此，dsx被視為節肢動物性別決定機制的中心環節[3-4]。

據報道，在完全變態的昆蟲綱動物中dsx基因主要通過特異性剪接，從而產生雄性和雌性特異性dsx蛋白質而實現性別調控機制[5]。例如，dsx基因最早在黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）中發現（Dmdsx），其在雌雄個體中都表達，但受到不同的調控發生性別特異的可變剪接，生成雌雄特異的DmdsxF和DmdsxM[6]。Dmdsx的前體mRNA(pre—mRNA)由6個外顯子構成，在外顯子4上存在6個由13個核苷酸組成的重復元件(dsxRE)，該元件是外顯子剪接增強子[6]。在已研究的大多數雙翅目昆蟲中，調控同源基因dsx的可變剪接的分子機制與果蠅一樣，例如岡比亞按蚊的dsx基因編碼兩個選擇性剪接的轉錄物，AgdsxF和AgdsxM，控制兩性的分化[7]。鱗翅目可變剪接的機制與果蠅并不相同，其不含有dsxRE。例如，家蠶（Bombyxmori）的dsx通過特異性剪接外顯子3和4產生雌性dsxF，特異性剪接外顯子2和外顯子5產生雄性dsxM，而雌性特異性的BmdsxF被證明是其默認可變剪接的產物[8]。在鞘翅目中，赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）Tcdsx的前體mRNA特異性剪接成三個雌性剪接體（TcdsxF1、TcdsxF2和TcdsxF3）和一個雄性特異性TcdsxM剪接體，雌性特異性外顯子和相鄰的內含子序列中發現了可能參與Tcdsx前體mRNA性別特異性剪接的順式調控元件[9]。在膜翅目中，蜜蜂（Apismellifera）的Amdsx經過可變剪接產生了一種雄性特異的AmdsxM，兩種雌性特異的AmdsxF和一種雌雄共有的AmdsxC，雌性dsx剪接是默認的，而雄性剪接體通過抑制雌性的剪接而產生的，并且其可變剪接受到基因Amfem的調控[10]。

然而，在對半變態的昆蟲dsx基因研究結果表明，其dsx并不存在特異性剪接。例如，半翅目的長紅錐蝽（Rhodniusprolixus）有三種Rpdsx亞型，一個雌性特異性dsx（Rpdsx1）和兩個雄性特異性dsx（Rpdsx2和Rpdsx3），但雌雄的dsx并不存在特異性剪接[11]。煙粉虱（Bemisiatabaci）的dsx基因編碼28個異構體，但其缺乏性別特異性剪接異構體[12]。虱目的雌雄人虱均有兩種dsx亞型（Phdsx1和Phdsx2），均在兩性中表達。這些結果提示了性別特異性dsx剪接可能出現在昆蟲進化的早期，而半變態的兩性之間的dsx異構體可能發生性別特異性剪接的喪失。

目前半變態的昆蟲的dsx性別調控機制仍不清楚，因此，本研究分離并鑒定了紅帶錐蝽dsx基因，分析了其在紅帶錐蝽不同發育階段及雌雄的表達譜，以期為解析紅帶錐蝽dsx性別調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 紅帶錐蝽飼養 選用飼養于中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所（國家熱帶病研究中心）紅帶錐蝽廣東順德株[13]，實驗室傳代14代。紅帶錐蝽卵及各個發育期飼養條件均為：溫度（28±1）℃、相對濕度（70±5）%、恒溫恒濕培養箱中12 h光照和12 h黑暗。飼血每周一次，均為昆明鼠體。

1.2 總RNA 提取和 cDNA 合成 分別收集紅帶錐蝽卵、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期齡若蟲、雌性成蟲和雄性成蟲。使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit（No.74104）試劑盒對樣本進行總RNA提取。其中卵、幼蟲與成蟲均為1只。各樣品總RNA經酶標儀NanoDrop ND-2000（美國NanoDrop公司)定量檢測后，用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）逆轉錄試劑盒去除基因組DNA并合成cDNA，產物于-20℃冰箱保存備用。

1.3 克隆TrdsxB基因的全長ORF序列 使用Primer Premier 5.0 軟件對Trdsx進行引物設計，得到引物TrdsxBF1與TrdsxBR1（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并稀釋到10 μmol/mL的濃度備用。以12.5 μL全式金公司的2×EasyTaq?PCR SuperMix、10 μL無核酸酶滅菌水、0.5 μL模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物為標準體系對Trdsx基因進行PCR擴增。所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，使用全式金公司的pEASY?-T1 Cloning Kit進行TA克隆?？寺悠匪蜏y序公司測序分析。

表1 紅帶錐蝽TrdsxB基因克隆與表達檢測參數與引物信息Table 1 Primers and programs for gene cloning and expression detection of TrdsxB in T.rubrofasciata

1.4TrdsxB序列比對 在NCBI上導出三種模式動物的dsx氨基酸序列：黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster,GenBank登錄號：AHN57219）、長紅錐蝽（Rhodnius prolixus,GenBank登錄號：QGB21101）、煙粉虱（Bemisiatabaci,GenBank登錄號：AWC26116），使用MEGA 6.0軟件進行多重氨基酸序列比對。比對參數：空位開放（gap opening penalty）15，空位延伸（gap extension penalty）6.66，延遲趨異序30%，蛋白質加權矩陣Gonnet。

1.5 系統發育樹分析 我們選擇昆蟲綱下不同目屬的dsx蛋白同系物氨基酸序列建立進化樹，包括蜻蜓目的長葉異痣蟌（Ischnuraelegans,GenBank登錄號：XP046401714.1）、稀少追逐蜓（Ladonafulva,GenBank登錄號：KAG8238589.1），蚤目的貓櫛頭蚤（Ctenocephalidesfelis,GenBank登錄號：XP026469487.1），蜚蠊目的隱尾蠊（Cryptocercus punctulatus,GenBank登錄號：BCX65400.1）、德國小蠊（Blattellagermanica,GenBank登錄號：QGB21106.1），雙翅目的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster,GenBank登錄號：NP524272.4）、昆士蘭實蠅（Bactroceratryoni,GenBank登錄號：AAB99947.1），鱗翅目的家蠶（Bombyx mori,GenBank登錄號：NP001104815.1）、舞毒蛾（Lymantriadispar,GenBank登錄號：BAN82532.1）、美鳳蝶（Papiliomemnon,GenBank登錄號：BAX24553.1）、冬尺蠖蛾（Operophterabrumata,GenBank登錄號：KOB69684.1），膜翅目的西方蜜蜂（Apismellifera,GenBank登錄號：NP001128408.1），半翅目的溫帶臭蟲（Cimex lectularius,GenBank登錄號：XP014241968.1）、球蚜（Adelgescooleyi,GenBank登錄號：XP050436429.1）、葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae,GenBank登錄號：XP050519863.1）。使用MEGA6.0軟件進行多重蛋白序列比對后，使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行類聚分析，Bootstrap法評估結果可信度（1000次重復），以甲殼綱的中國對蝦（Penaeuschinensis,GenBank登錄號：AUT13216.1）作為外群建立進化樹進行分析。

1.6TrdsxB在紅帶錐蝽不同發育階段的表達水平分析 使用所得的cDNA序列為模板設計出qTrdsxBF與qTrdsxBR兩條引物（表1），采用相對定量的方法對紅帶錐蝽不同發育階段的Trdsx基因表達水平進行測定。實驗使用Bio-Rad C1000熒光定量PCR儀、全式金Green qPCR SuperMix。反應體系如下：Green qPCR SuperMix 10 μL、10 mmol/L 正、反向引物各0.5 μL、稀釋10倍的cDNA 1 μL、無核酸酶滅菌水補足到20 μL。每個樣品以及陰性對照做3組平行重復，另外再做3個無模板的陰性對照。反應結束后，對Ct值采用2－△△Ct法進行處理，從而定量分析dsx基因在紅帶錐蝽不同時期的表達水平，并進行LSD多重比較檢驗，根據數據作柱形圖。

2 結果

2.1TrdsxB的鑒定與分子結構特點 分別以雌雄成蝽cDNA為模板，使用兩條引物對TrdsxB全序列進行PCR擴增并克隆鑒定，根據測序結果進行序列拼接后得到該基因全長開放性讀碼框序列，命名為TrdsxB，其基因提交GenBank（GenBank登錄號：OQ168410）。TrdsxB長度為948 nt，編碼315個氨基酸。通過與紅帶錐蝽基因組（GenBank 登錄號：PRJNA516044）比對，得到TrdsxB相應外顯子和內含子的數目、分布等信息。TrdsxB基因位于12號常染色體，基因橫跨約30 kb長度，mRNA由4個外顯子構成（圖1），起始密碼子位于第1個外顯子，終止密碼子位于第 4 個外顯子。

圖1 Trdsx基因結構Fig.1 Trdsx gene structure

2.2TrdsxB結構域預測與其他物種同源蛋白的比較TrdsxB基因的分子排列形式與已知物種的dsx基因分子排列類似，存在一個與所有Dmrt性別基因共有的保守多聚化結構域（DM）和一個泛素相關（ubiquitin-associated，UBA）結構域（圖2）。我們通過在線motif預測工具meme（http://meme.nbcr.net/meme/）分析了TrdsxB基因序列，得到部分motifs，結果圖見圖2。

圖2 Trdsx蛋白一級結構圖Fig.2 Primary structure of Trdsx protein

通過與Dmdsx、Btdsx、RPdsx蛋白比較，我們發現Trdsx DM結構域中同樣存在較為保守的OD1結構域和一定特異的OD2結構域。其中OD1結構域包含了一個鋅指結構（atypical zinc-finger domain）[14]，具有保守的鋅螯合殘基C2H2C4（圖3）。連接OD1與OD2的區域在同屬半翅目的紅帶錐蝽、長紅錐蝽、煙粉虱之間較為相近，這個區域主要富含精氨酸、亮氨酸與谷氨酸（圖3）。

圖3 紅帶錐蝽、長紅錐蝽、煙粉虱和黑腹果蠅dsx 蛋白的多重序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of dsx proteins of T.rubrofasciata,R.prolixus,B.tabaci and D.melanogaster

2.3Trdsx系統進化樹特點 將不同種類昆蟲dsx基因編碼的氨基酸挑選出來并拼接后，以甲殼綱的中國對蝦作為外群繪制系統發育樹。結果顯示，半翅目種群與蜻蜓目、蚤目、蜚蠊目、雙翅目、鱗翅目、膜翅目等六個目屬的進化距離均較遠，其中蜻蜓目與蚤目的進化距離較近屬于同一分支。在半翅目中紅帶錐蝽與葡萄根瘤蚜在同一分支中，親緣性較近（圖4）。

圖4 不同昆蟲dsx蛋白進化樹Fig.4 Dsx protein phylogenetic tree of different insect species

2.4TrdsxB的表達特點 使用qTrdsxBF與qTrdsxBR兩條引物，以紅帶錐蝽cDNA作為模板研究紅帶錐蝽TrdsxB基因在不同發育階段的表達水平。結果顯示，胚胎時期TrdsxB大量表達，之后表達量降低，四期若蟲的表達量最低，然后再逐漸升高。且雄性與雌性之間的表達量存在差異（圖5）。

圖5 紅帶錐蝽Trdsx不同發育時期的相對表達量（圖中數據為平均值±標準誤差，分別以卵表達量為基準）Fig.5 The relative expression of TrdsxB at different developmental stages (the data in the figure is mean±standard error,were based on egg expression)

3 討論

美洲錐蟲病，又稱恰加斯?。–hagas disease），是一種由鞭毛體原蟲－克氏錐蟲引起的人畜共患熱帶病。根據最新的估測，目前在拉丁美洲大約有700萬人感染美洲錐蟲病，有1億人處于風險之中。在最近的幾十年內，美洲錐蟲病流行病學發生重大變化，輸入性的美洲錐蟲病在歐洲的許多地區以及日本、澳大利亞、新西蘭等國家均有報道[15-18]，已經成為重要的全球性公共衛生問題。紅帶錐蝽是已記錄的被證實能自然感染克氏錐蟲，是克氏錐蟲能在其體內定殖的錐蝽之一[19]。在已記錄的151種可傳播美洲錐蟲病的錐蝽中，紅帶錐蝽是已知的全球范圍內分布最為廣泛的一種錐蝽。近年來，紅帶錐蝽已被證實在我國沿海地區廣泛分布[20]。最新的研究證實，紅帶錐蝽不僅可以作為克式錐蟲和布氏錐蟲的傳播媒介，還可以自然感染T.lewisi和T.conorhini兩種錐蟲，且T.lewisi和T.conorhini均可感染人。目前在泰國、馬來西亞、巴西、岡比亞、印度等地均有人感染T.lewisi和T.conorhini的病例報道[21]。另有研究表明，T.lewisi對人類特異性血清載脂蛋白誘導的錐蟲溶解具有天然抵抗力，由此可見紅帶錐蝽傳播的T.lewisi可能是一個被低估，被忽視的感染人的病原體[21]。目前我國存在極少量的輸入性錐蟲病，未有相關的本地錐蟲病病例出現，但紅帶錐蝽的存在依然給我國錐蟲病的防控增加了許多風險和挑戰。對紅帶錐蝽的防制無疑是預防和控制錐蟲病等疾病最有效的措施之一，目前對病媒的防制主要依賴于殺蟲劑的使用，然而過度和持續使用殺蟲劑導致了昆蟲抗藥性的增強，并存在環境污染的可能[22-24]，因此生物防制是更為適合的方式。隨著生物信息學的發展與比較基因組學的興起，越來越多的昆蟲基因組被報道，加快了性別調控機制研究的步伐[25-26]。通過同源基因比對，可以幫助大家快速的找到性別調控級聯通路上同源的關鍵基因，還可以挖掘新物種中性別調控通路上其他的侯選關鍵基因[27-28]。因此，本研究參考已發布的紅帶錐蝽的全基因組[29]數據，對紅帶錐蝽性別決定基因TrdsxB進行了克隆與鑒定。

本研究結果顯示，TrdsxB中存在4個外顯子，但并不存在特異性剪接，該結果與具有多種選擇性剪接模式的雙翅目昆蟲（如岡比亞按蚊[30]、果蠅[31]等）、鱗翅目昆蟲（如家蠶[32]）以及鞘翅目昆蟲（如赤擬谷盜[33]）不同，但與同屬半翅目且雌雄的dsx并不存在特異性剪接的長紅錐蝽[34]一致。關于昆蟲的性別調控通路的研究顯示，dsx蛋白擁有共同的氨基端與雌雄特異的羧基端。雌雄共同的氨基端包含DNA結合結構域（DM domain）、中間蛋白寡聚結構域（dimer domain）[35]。本研究所得的TrdsxB也符合這一特征，存在一個與所有Dmrt性別基因共有的保守多聚化結構域和一個泛素相關（UBA）結構域[36]。其中DM結構域包含了一個具有保守的鋅螯合殘基C2H2C4的鋅指結構，該結構與家蠶中雄性特異性的CCCH型鋅指結構不同[32]，屬于C2H2型，關于該結構是否屬于能與RNA結合的特殊鋅指結構還有待研究[37-38]。UBA結構域則是一個初級的α螺旋結構，具有三螺旋束結構，是參與泛素介導的蛋白水解的蛋白質中常見的序列基序，用于與DNA相互作用。早期胚胎性別決定原始信號激活級聯基因性別特異選擇性剪切，級聯基因性別特異產物調控個體分化為雄性或者雌性[39]。在對TrdsxB所預測的motifs中存在與卵黃形成相關的結構域，該結構域同樣存在于家蠶中，可以激活雌性家蠶的信息素結合蛋白（pheromone-binding protein,pbp）異性表達，抑制雄性信息素結合蛋白特異性基因的表達[40]，而模式生物果蠅的Dmdsx所編碼的蛋白會與卵黃蛋白基因（Yp）結合調控卵黃蛋白基因的表達[6]。由此，本研究推測Trdsx基因與雌性的發育也許存在更為緊密的關聯，這種功能的差異或許與該基因中所存在的卵母細胞分化功能域相關。

同時，RT-PCR結果顯示，本次研究所得的TrdsxB基因在雌雄兩種成蟲中均有表達，且雌性表達量高于雄性，提示Trdsx對紅帶錐蝽的性別具有重要的作用。各個發育階段的Trdsx表達水平結果顯示，Trdsx在早期胚胎中就出現了表達且表達量極高，之后表達量逐漸降低直到四期若蟲后再逐漸升高，同樣的表達方式也存在于岡比亞按蚊的AngdsxM[30]和煙粉虱的Btdsx[41]中，間接提示dsx可能在早期屬于一種母體基因（maternal gene）。進化樹結果顯示，本研究所鑒定的TrdsxB與已知的半翅目屬的蚜蟲dsx之間具有較高的同源性。由此可見，部分半翅目昆蟲的dsx基因能為紅帶錐蝽的Trdsx基因研究提供參考，為后期紅帶錐蝽性別決定機制的研究指明了方向。

本研究將紅帶錐蝽性別調控機制研究的doublesex基因作為突破口，對其進行克隆，同源性分析并通過定量分析其時空表達的差異性，為進一步研究紅帶錐蝽性別調控機制奠定基礎，進而為探索和開發紅帶錐蝽防制策略提供新的思路。