液相色譜質譜法測定雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物殘留量的不確定度評定

張麗芳，康俊杰，張建雄，鄭百芹，劉 洋

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，唐山 063000；2.河北省農產品質量安全檢測技術創新中心，唐山 063000；3.唐山市功能性農產品產業技術研究院，唐山 063000；4.農業農村部農產品質量監督檢驗測試中心（唐山），唐山 063000））

尼卡巴嗪（nicarbazin）又名球蟲凈，是一種廣譜、高效和性能穩定的抗球蟲藥，可有效預防和治療雞等禽類的球蟲病。它預防效果好，耐藥性極慢，安全性高，有促生長作用，被廣泛應用于雞的養殖環節[1-2]。尼卡巴嗪由4,4-二硝基均二苯脲（4,4'-Dinitrocarbanilide,DNC）與2-羥基-4,6-二甲基嘧啶（2-hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine,HDP）兩種化合物組成，兩者均由家禽消化道吸收，并廣泛分布于組織及體液中。DNC通過糞便排出，代謝緩慢，HDP以尿液排出，代謝消除迅速[3]。國內外均以DNC作為尼卡巴嗪在雞組織中的殘留標志物[4]。GB31650-2019[5]規定尼卡巴嗪殘留標志物在雞的所有組織中最高殘留限量為200 μg/kg。雞組織中殘留的DNC經烹飪加熱后可誘導產生對硝基苯胺[6]，此化合物具有高毒性。尼卡巴嗪在禽類組織中不同程度的殘留會對人體健康產生潛在危害[7-8]。

測量不確定度定義為表征合理地賦予被測量之值分散性的非負參數。它是定量闡明檢測結果品質優良的重要指標[9-11]，同時可分析和評定影響測量結果準確性的各個分量，充分掌握關鍵因素，提高結果的準確性和可靠性。不確定度作為合格判定的重要參考依據，將最大限度地減少最大殘留限量附近殘留水平合規決定中可能存在的爭議[12-13]。CNASGL006:2019《化學分析中不確定度的評估指南》[14]改進了當測量結果接近于零時的不確定度評定，完善了帶有測定不確定的結果的符合性判定指南，使實驗室對提供測量不確定度的要求和方法日趨明確。目前獸藥殘留量的測量不確定評定方法仍不成熟[15-19]，存在一定的局限：如方法回收率未作為評定的考慮因素，忽略試劑的膨脹，量器在計算不確定度過程中選擇矩形分布、三角分布或正態分布計算方式不明確等。本文以GB29690-2013[20]《食品安全國家標準 動物性食品中尼卡巴嗪殘留標志物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》為檢測方法，采用液相色譜質譜法對雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物殘留量進行測定，依據JJF1135 -2005[21]《化學分析測量不確定度評定》、JJF1059.1-2012[22]《測量不確定度評定與表示》和CNAS- GL006-2019，綜合考慮各個因素，進行測量不確定的評定，建立雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物殘留量不確定度評定的數學模型，分析影響測量結果準確性的各關鍵因素，加強質量控制，為科學評價藥物殘留量結果提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 標準物質4,4'-二硝基均二苯脲（含量100 μg/mL，不確定度5%）和4,4'-二硝基均二苯脲-D8（含量100 μg/mL，不確定度5%），均購自天津阿爾塔有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）購自德國Merck；無水硫酸鈉（分析純）購自天津福晨化學試劑；試驗用雞肉樣品購自當地超市。液相色譜-串聯質譜儀（Waters Xevo TQ）購自美國Waters公司；電子天平（HZ2004A）購自常州市衡正電子儀器有限公司；臺式離心機（D37520）購自德國Thermo公司；氮吹儀（TTL-DC）購自北京同泰聯科技發展有限公司。

1.2 試液配制 75%甲醇水：量取甲醇75 mL，用水溶解稀釋至100 mL；75%甲醇水飽和的正己烷：取75%甲醇水100 mL，加正己烷100 mL，搖勻靜置分層，取上層液；4,4'-二硝基均二苯脲貯備液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲標準物質1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容制備成10 μg/mL的儲備液；1.2.4 4,4'-二硝基均二苯脲中間液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲儲備液0.1 mL分別置于1 mL容量瓶中，用75%甲醇水定容制備成1 μg/mL的中間液；4,4'-二硝基均二苯脲-D8內標工作液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲-D8標準物質0.1 mL置于100 mL容量瓶中，用75%甲醇水定容制備成100 ng/mL的內標工作液；標準工作曲線的制備：吸取4,4'-二硝基均二苯脲中間液液0.02 mL 置于10 mL容量瓶中；吸取4,4'-二硝基均二苯脲儲備液0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.2 mL、0.5 mL置于10 mL容量瓶中，準確移取4,4'-二硝基均二苯脲-D8工作液1.0 mL置各容量瓶中，用75%甲醇水定容，制備成2、10、20、50、200、500 ng/mL的標準曲線，4,4'-二硝基均二苯脲-D8內標濃度10 ng/mL。

1.3 試樣提取與凈化 稱取待測雞肉2.00±0.02 g，于50 mL離心管中，添加100 ng/mL 4,4'-二硝基均二苯脲-D8內標工作液100 μL，加無水硫酸鈉2 g，乙腈8 mL，渦旋0.5 min，超聲5 min，5000 ×g離心10 min，取上清液，于40℃氮氣吹干，加75%甲醇水飽和的正己烷1 mL，渦旋10 s，再加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分渦旋混合，于40℃水浴中靜置5 min，2000 ×g離心5 min，取下層清液，濾膜過濾，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 儀器條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5.0 μL；流動相：A水，B乙腈；梯度洗脫：0-0.50 min，10%B；0.50-1.20 min，10%B-90%B；1.20-2.10 min，90%B；2.10-2.20 min，90%B-10%B；2.20-3.20，10%B。

電噴霧離子源；負離子掃描；多反應監測；-3500V電噴霧電壓；源溫：110℃；霧化溫度：350℃；霧化氣流速：450L/h；錐孔氣流速：50L/h；監測離子：DNC 300.9＞136.9（定量），300.9＞106.9（定性），DNC-D8內標300.9＞141.0。

2 結果

2.1 不確定度來源分析 根據試驗檢測步驟和建立的數學模型，影響LC-MS/MS測定雞肉中DNC殘留量不確定度的因素有以下幾個方面：①標準溶液配制引入的不確定度urel（C）；②內標加入體積引入的不確定度urel（N）；③稱樣量引入的不確定度urel（M）；④樣品前處理過程引入的不確定度urel（E）；⑤樣品的重復測定引入的不確定度urel（X）；⑥標準曲線擬合引入的不確定度urel（Y）；⑦回收率測定引入的不確定度urel（fR）。

2.2 標準溶液配制引入的不確定度

2.2.1 標準物質引入的不確定度 依據標準物質證書，4,4'-二硝基均二苯脲的擴展不確定為5%（k=2），其相對標準不確定為0.05/2=0.025，4,4'-二硝基均二苯脲-D8內標的擴展不確定度為5%（k=2），其相對標準不確定為0.05/2=0.025，標準物質引入的相對不確定度為urel（C1）

2.2.2 標準儲備液配制引入的不確定度 配制標準儲備液時，用1000 μL的移液器移取100 μg/mL的標準物質1000 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/mL的儲備液。該過程不確定度的引入涉及到試劑膨脹、移液器和容量瓶的影響。實驗室溫度通常在20℃±5℃，甲醇的膨脹系數為0.00118℃-1，服從矩形分布，引入的不確定度為0.00118×5/=0. 00341；1000 μL移液器檢定證書給出的擴展不確定度為0.3%（k=2），引入的不確定度為0.003/2=0.00150；A級10 mL容量瓶檢定給出的不確定度為0.008 mL（k=2），引入的不確定度為0.008/2/10=0.00040。標準儲備液配制引入的不確定度urel（C2）==0.00375。

2.2.3 標準工作曲線配制引入的不確定度 由標準曲線配制過程可知，稀釋定容過程使用10 mL容量瓶6次，1 mL容量瓶1次，100 μL可調移液器5次，1000 μL可調移液器2次。

2.2.4 容量瓶引入的不確定度 容量瓶引入不確定度的因素：①容量瓶檢定的允許擴展不確定度；②實驗室溫度波動引起的體積變化。75%甲醇水體積膨脹系數為0.000937℃-1，計算如表1。

表1 稀釋過程中容量瓶引入的不確定度Table 1 Uncertainty of the volumetric flask in the dilution process

2.2.5 可調移液器引入的不確定度 標準工作曲線配制過程中使用100 μL、1000 μL移液器移取不同體積液體，引入不確定度的因素：①移液器本身的允許擴展不確定度；②實驗室溫度波動引起的體積變化，根據儀器根據實際操作和檢定證書，將標準工作曲線稀釋過程可調移液器引入的相對不確定度計算如表2。

表2 稀釋過程中可調移液器引入的不確定度Table 2 Uncertainty of the pipette in the dilution process

綜上，標準工作曲線配制引入的相對標準不確定度urel（C3）=0.02379。

2.2.6 標準溶液配制引入的合成不確定度 綜上，標準溶液配制引入的相對不確定度為urel（C）

2.3 內標加入體積引入的不確定度 內標配制濃度為100 ng/mL，標準工作曲線定容體積均為10 mL，標準工作曲線中內標加入量為1.0 mL，試樣中內標加入量為100 μL，試樣經提取定容處理后，標準曲線和試樣上機濃度均為10 ng/mL，內標維持在同一水平。內標配制過程產生的不確定度帶來的影響可以忽略，只考慮標準曲線中內標加入體積帶來的不確定度urel（1000 μL內）和試樣中內標加入體積帶來的不確定度urel（100 μL內）。內標加入體積引入的不確定度urel（N）計算過程如表3。

表3 相對標準不確定度urel（N）Table 3 Relative standard uncertainty urel（N）

2.4 樣品稱量引入的不確定度 試樣經高速均質機勻漿，樣品的均勻性引入的不確定度可忽略。根據分析天平的校準證書，最大允許偏差為0.01 g，稱量樣品2.00 g，服從矩形分布，由稱量引起的不確定度urel

2.5 樣品前處理過程引入的不確定度 定容步驟為加75%甲醇水溶液1.0 mL。75%甲醇在20℃±5℃條件下的體積膨脹系數為0.000 937℃-1，其相對不確定度為0.00 270。1.0 mL使用1000 μL移液器移取，其允許擴展不確定度為0.3%，引入的不確定度為0.00 150。前處理過程引入的合成不確定度為urel（E）0.00 309。

2.6 樣品重復測定引入的不確定度 在空白基質中添加DNC標準物質，制成5 μg/kg的陽性樣品，重復測定6次，計算樣品重復測定引入的不確定度，結果如表4。

表4 雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物含量重復測定結果Table 4 Repeated determination results of nicarbazine residue marker in chicken

樣品重復測定引入的不確定度為A類不確定度，根據表5重復測定結果，計算樣品重復測定的標準偏差為：=0.08050；樣品重復測定的標準不確定度U（X）==0.03286；樣品重復測定引入的相對標準不確定度urel（X）==0.00771。

表5 4,4′-二硝基均二苯脲標準曲線測定結果Table 5 Results of 4,4′-Dinitrocarbanilide standard curve

2.7 標準曲線擬合引入的不確定度 系列濃度為2、10、20、50、200、500 ng/mL的標準曲線中含有濃度為10 ng/mL的內標溶液。因使用內標校準，則以待測物峰面積和內標物峰面積的比值為橫坐標，以待測物濃度和內標物濃度比值為縱坐標，建立標準曲線，標準曲線測定結果如表5。

其中，p為標準溶液測定次數（p=6）；

標準曲線擬合引入的標準不確定度：U（Y）

其中：SR為標準曲線擬合的剩余標準差；a為曲線的斜率；n為樣品重復測定次數（n=6）；Ci為標準溶液各點的濃度；C樣平均為重復測定樣品提取液DNC濃度的平均值；C平均為標準溶液各濃度的平均值；p為標準溶液測定次數（p=6）。

2.8 回收率引入的不確定度 在雞肉中分別添加質量濃度為5、25、50 μg/kg的目標分析物，每個濃度作3個平行，回收率計算結果如表6，回收率引入的相對標準不確定度urel（fR）=0.02411

表6 回收率測定結果與不確定度Table6 The recovery and uncertainty of pesticides

2.9 合成標準不確定度及貢獻率 根據各分量評定的相對標準不確定度，合成尼卡巴嗪殘留標志物殘留量的測量相對標準不確定度，并評定各個分量對測量不確定度的貢獻率，結果如表7。依據JJF1059.1-2012，不確定度為U（X）=4.26×0.005459=0.23 μg/kg，擴展不確定度為U=K×U（X）=0.46 μg/kg。因此，用液相色譜質譜法測定雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物的含量時，擴展不確定為0.46 μg/kg（k=2），試樣中尼卡巴嗪殘留標志物的含量表示為：4.26±0.46 μg/kg（k=2）。各分量對合成不確定度的影響從大到小依次為標準溶液配制、回收率、標準曲線擬合、樣品重復測定、前處理過程、內標加入體積、稱量。

表7 尼卡巴嗪殘留標志物殘留量測定的合成不確定度Table 7 The relative standard uncertainty of nicarbazine residue marker

3 討論

本文按照GB 29690-2013對雞肉中尼卡巴嗪殘留標志物殘留量進行檢測，通過對整個試驗過程不確定度來源的分析和評定，確定影響測量結果不確定度的主要因素為標準溶液配制、回收率和標準曲線擬合。評估結果與蒙麗瓊等[23]研究基本一致，但三個因素的順序不同?？剂吭?，與標準物質自身的不確定度和稀釋過程有關。黃榮浪等[24]認為不論試驗結果是否折算回收率，回收率對試驗結果的不確定度均存在顯著影響，與本文評定結論一致。已報道的對回收率的不確定評定均采用一個添加濃度的平行測定，本文對高、中、低三個濃度進行評定，主要考慮了實際待測樣品殘留量的不確定性。李文杰等[25]評定水產品中氟苯尼考殘留量測量不確定度的結論為標準曲線工作液配制、曲線擬合是主要因素，回收率的影響并不突出，考慮可能與所評定目標物本身的性質和檢測方法有關。

為完善該檢測方法的質量控制體系，在日常工作中應對標準溶液配制、回收率和標準曲線擬合等幾個關鍵步驟嚴格控制，保證檢測結果質量。標準溶液配制過程對合成不確定的貢獻率較大，主要與量器誤差、量器使用頻次，以及實驗人員的操作水平有關[26-27]。在配制標準溶液時，應選擇國家認可的標準物質中心生產的合格、有效的標準物質，盡量減少稀釋定容過程，考慮待測樣品實際含量的不確定性和儀器的檢測性能，選擇合適梯度濃度的標準工作曲線，降低由標準曲線擬合引入的不確定度。建議在進行準確度要求較高的測量時，如：能力驗證、盲樣考核、檢出值在限量值附近等情況時，標準曲線方法得到初步結果后，選擇單點校正的方式進行確定，可有效降低檢測過程中的不確定度?；厥章鼠w現了檢測過程中對目標物的提取和凈化效率，可通過優化前處理過程、配制基質標液降低機制效應等方法提升加標回收率。此外，試驗過程中使用的量器必須檢定合格；加強儀器的維護保養，保證測定時儀器處于最佳狀態；提高檢測人員的操作水平，配合多種質控手段，有效控制和提高實驗室的數據質量，為藥物殘留量測量結果的科學性提供依據。