程序性鐵死亡及其與蜱唾液腺退化關系的研究進展

袁冬琪，曹杰，周金林

（中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241）

1 程序性鐵死亡

2012年，Dixon等[3]首次報道了程序性鐵死亡（Ferroptosis）相關的研究。程序性鐵死亡是一種鐵依賴性的，由一種新型化合物Erastin誘導的，區別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型的細胞死亡方式。鐵作為人體必需的微量元素，主要存在于血液的血紅蛋白中，參與氧的運輸以及生物氧化過程[4]。然而，細胞內鐵含量過載時，可以引起線粒體氧化磷酸化途徑異常，產生大量的活性氧類（reactive oxygen species，ROS），在二價鐵或酯氧合酶的作用下，氧化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，從而誘導細胞死亡。因此，在細胞形態上，程序性鐵死亡較為標志性的表現為細胞線粒體變小，膜密度增高，嵴減少；細胞成分上表現為脂質過氧化增高以及ROS增高。

根據目前的相關研究來看，程序性鐵死亡通過清除環境中缺乏關鍵營養素或因感染或環境壓力而受損的細胞，在抑制腫瘤發生中起著關鍵作用，逐漸被認為是消除惡性細胞、減輕毒素損傷的一種適應性特征[5]?？梢娪谝恍┎±頁p傷，如脂質過氧化引起的毒素作用，缺血再灌注損傷，血色素沉著小鼠模型，而且可能在谷氨酸誘導的興奮性毒性過程中導致細胞死亡。也有報道說明程序性鐵死亡與神經退行性疾病有關[4]。這些研究表明，程序性鐵死亡是一種程序性細胞死亡方式，且可能與動物生理和病理進程密切相關。

1.2 程序性鐵死亡與細胞凋亡、自噬、壞死的區別及聯系 細胞死亡的方式依照表觀形態學可分為細胞凋亡、細胞自噬以及細胞壞死等不同的死亡方式[6]。細胞凋亡是為了維持體內環境穩定，由基因控制的自發的、有序的死亡方式[7]。在形態上表現為細胞體積縮小，與周圍的細胞脫離，細胞質密度增加，核質濃縮，核膜核仁破碎，最終形成凋亡小體[8]。細胞自噬則會形成與溶酶體融合的自噬小體[9]。而細胞壞死則表現出明顯的炎癥反應，細胞器腫脹，細胞質膜破裂，胞內物質釋放[9]。

與以上三種細胞死亡方式均不同，程序性鐵死亡在生物化學方面會出現鐵離子累積、谷胱甘肽（Glutataione,GSH）耗竭，在細胞形態上主要表現為線粒體變小、膜密度增高、線粒體嵴減少或消失、細胞膜斷裂和出泡等，細胞核中變化不明顯[3,10]。但程序性鐵死亡尚未有類似凋亡小體形成的特征性形態表現被發現，目前對程序性鐵死亡是否發生的表觀形態學判斷主要依賴于線粒體形態的變化。

根據現有的一些研究，程序性鐵死亡可能與其他細胞死亡方式存在一些聯系。2015年，Fearnhead等[5]發現，在癌癥發展中有介導細胞凋亡作用的蛋白p53，對程序性鐵死亡也有調控作用。2019年，Zhang等[11]報道了BRD7-P53-SLC25A28形成的信號通路在調節肝星狀細胞（Hepatic stellate cells,HSCs）鐵死亡過程中起關鍵作用。這表明程序性鐵死亡可能與細胞凋亡存在互作。馬德亮等[12]認為，鐵死亡/凋亡混合途徑是一種新的癌癥治療策略。2018年，Zhang等[13]發現，ELAVL1與BECN1 mRNA的相互作用是觸發自噬激活的關鍵分子事件，可促進自噬型鐵蛋白降解，進而導致程序性鐵死亡。2019年，根據Wu等[14]的研究，分子伴侶介導的細胞自噬參與了程序性鐵死亡的執行。同時有研究表明，鐵蛋白的自噬轉化（Ferritinophagy）是引起程序性鐵死亡的關鍵[15]。由此可見，程序性鐵死亡是一個細胞自噬性死亡過程[16]。

2 程序性鐵死亡的機制

2020年，Hadian等[17]繪制了較詳細的程序性鐵死亡通路圖（圖1）。程序性鐵死亡會由脂質代謝異常、鐵代謝異常以及氨基酸代謝異常引起。本文將從此三個方向闡釋程序性鐵死亡機制并總結程序性鐵死亡在近年來的研究進展。

圖1 程序性鐵死亡機制[17]Fig.1 The mechanism of ferroptosis

2.1 脂質代謝異常 脂質作為構成生命體的基本物質來說，其代謝與生命體執行正常功能密不可分。在細胞死亡方面，細胞內飽和脂肪酸與單聚不飽和脂肪酸的比例增加，是啟動細胞凋亡途徑的信號之一[18]；而長鏈脂肪酸增加時，細胞壞死途徑可被啟動[19]。對于程序性鐵死亡來說，脂質氧化應激及其引起的膜損傷是致使其發生的關鍵[20]。而其中，具有不穩定的碳碳雙鍵的多不飽和脂肪酸（fatty acids,PUFAs）是引起脂質過氧化形成大量脂質活性氧的主要來源[21]。

在室女絕戶繼承體現了女性財產權的相對獨立。所謂相對，代表女性依舊不是可以和男子享有相同財產權利的民事主體，這是“一準乎禮”的法律制度下的必然結果。所謂獨立是指，女子的繼承權尤其是在南宋時期擴大了，女性在繼承份額、對奩資的處分權等方面都有所擴大，它的存在具有與此相對應的社會、法律、經濟基礎。

程序性鐵死亡的調節涉及控制關鍵磷脂底物的豐度，驅動其過氧化作用的因素，以及消除這些脂質過氧化物的因素[20]。當程序性鐵死亡發生時，由于對過氧化化學的固有敏感性，過氧化反應的底物是具有多不飽和?；驳牧字≒L-PUFAs），這些PL-PUFAs是由ACSL4和LPCATs等酶產生的，這些酶可以激活游離的PUFAs并將其轉化為磷脂[17]。2016年，Yang等[21]發現脂氧合酶（lipoxygenases,LOXs）通過依賴于磷酸化酶激酶G2（phosphorylase kinase G2,PHKG2）的鐵池來氧化PUFAs，這對于程序性鐵死亡的發生是必要的[21]。亦有研究證明PUFAs的含量和定位會對細胞內發生脂質過氧化的程度造成一定影響，繼而影響程序性鐵死亡發生的劇烈程度[22]。

2.2 鐵代謝異常 血液中含有豐富的鐵離子，是大多數生命體所必需的微量元素之一，其代謝與生命體維持穩態與正?；顒酉⑾⑾嚓P。因此，生物體內鐵的穩態受到嚴密的調控。正常情況下，在生物體中，細胞膜上的膜蛋白轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1,TfR1）將三價鐵離子轉運至細胞內，在內質網中被金屬還原酶STEAP3還原為二價鐵離子，之后在溶質載體家族11成員2/二價金屬離子轉運體（SLC11A2/DMT1）的介導下，從內體（Endosome），即膜包裹的囊泡結構，釋放到細胞質不穩定鐵池中[23]。當鐵離子代謝異常造成鐵蓄積時，即細胞內二價鐵離子增多時，會發生芬頓反應。芬頓反應指二價鐵離子與過氧化氫（H2O2）混合溶液發生的反應，具有將羧酸、醇、酯類等常見有機化合物氧化為無機態的強氧化性。在這里，細胞內過量的游離二價鐵與過氧化氫反應，產生可損害細胞DNA、蛋白質、脂質等的羥基自由基和高反應性的ROS，誘導程序性鐵死亡的發生[23]。2020年，Fang等[24]證明了將與三價鐵離子結合并對其進行轉運的鐵蛋白（Ferritin）基因敲除后，會加速心臟的程序性鐵死亡。鐵蛋白發生自噬釋放二價鐵離子后，促進過氧化，推動程序性鐵死亡的發生。程序性鐵死亡發生期間，當PL-PUFAs被納入到膜環境中，鐵依賴的酶和不穩定的鐵使用分子氧(O2)進行過氧化反應，產生PL-PUFA-OOH[20]。2017年，Doll等[25]發現程序性鐵死亡發生時，大量鐵離子分布于細胞線粒體及內質網中。因此，鐵的攝取、轉運和儲存都會對鐵死亡產生一定的調節作用[12]。

2.3 氨基酸代謝異常 氨基酸的代謝在程序性鐵死亡中也發揮著重要作用，主要表現在谷氨酸代謝方面。

胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（System Xc-），由輕鏈亞基（SLC7A11）和重鏈亞基（SLC3A2）通過二硫鍵連接形成的異二聚體，是細胞重要的抗氧化系統，Xc-在將細胞內的谷氨酸轉運到細胞外時，可將等量的胱氨酸轉運至細胞內[26]。胱氨酸進入細胞內后被還原成半胱氨酸，參與谷胱甘肽（glutathione,GSH）的合成。GSH作為細胞抗氧化系統的重要組成部分，可以清除自由基。在GPx4的催化作用下，GSH能夠將對細胞有毒性作用的脂質過氧化物還原為無毒的脂肪醇[27]。因此，高濃度的谷氨酸環境以及藥物如Erastin等可通過抑制Xc-對胱氨酸的轉運繼而影響GSH的合成，導致無法及時清理脂質過氧化物，誘導程序性鐵死亡發生[3]。因此，氨基酸代謝異常所引起的程序性鐵死亡本質上依然歸結于脂質過氧化物的產生。

2.4 程序性鐵死亡的關鍵分子 對于程序性鐵死亡來說，調節鐵死亡的關鍵是參與鐵代謝和脂質過氧化的各種分子和信號。

根據現有的研究來看，程序性鐵死亡的其中一條機制與谷氨酸的代謝有關。在最早報道程序性鐵死亡的研究中，新型化合物Erastin和谷氨酸一樣，通過抑制胱氨酸/谷氨酸的反向轉運體（Xc-）對胱氨酸的吸收，在細胞的抗氧化防御中創造一個空洞，最終導致鐵依賴性的氧化死亡[3]。GPx4作為抗氧化系統中維持谷胱甘肽平衡的關鍵酶，被認為是調控程序性鐵死亡的重要靶點[28]。2019，Gong等[29]研究證明GPx4敲除細胞會引起脂質過氧化物堆積最終引起程序性鐵死亡。2015年，Jiang等[30]報道抑癌蛋白p53通過抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運體的關鍵成分SLC7A11的表達，抑制胱氨酸攝取并使細胞對程序性鐵死亡作用敏感。2019，Fang等[24]研究證明心肌細胞膜上胱氨酸/谷氨酸反向轉運體的功能亞基SLC7A11下調導致的胞內胱氨酸和還原型谷胱甘肽（GSH）缺乏是誘發心肌細胞發生程序性鐵死亡的主要機制。由此可見，SLC7A11是程序性鐵死亡發生的一種關鍵作用分子。近年來，HMGB1逐漸被認為是程序性鐵死亡中的關鍵作用分子。HMGB1是一種通過RAS-JNK/p38通路的新型程序性鐵死亡調節因子[31]，Wen等[32]證明了HMGB1是由發生程序性鐵死亡的細胞以自噬依賴的方式釋放的一種損傷相關分子模式分子。

3 蜱唾液腺退化

3.1 硬蜱簡介 蜱對于生活在熱帶和溫帶地區的人類來說，是很常見的生物。在人類和動物之間的疾病傳播中，蜱起著重大作用，是僅次于蚊子的第二大傳播媒介?？蓪残l生、畜牧行業造成巨大影響。

蜱是專性寄生蟲，完全以大部分哺乳動物、鳥類等脊椎動物的血液為食。與其他節肢動物叮咬宿主快速吸血的方式不同，蜱進化出了一種特殊的長時間地附著于宿主皮膚上的吸血方式，即利用口器作為附著器，用來吸食血液。當到達宿主皮膚時，蜱蟲插入它的螯肢，切割并撕裂角質層、細胞表皮層和真皮外層，然后嵌入口器。血液很快從破裂的血管流到傷口部位，形成一個供血池。硬蜱在血池中緩慢吸血發育幾天，且吸血量較大，過程時長視成長階段而定。同時消耗所吸食血液，使身體逐漸擴張。

利用這種附著吸血方式，蜱的唾液腺通過在吸血過程中分泌大量生物活性分子，發揮抗凝血、抗炎癥、免疫抑制等功能[33]。促進血液和其他液體的流動，避免被宿主識別和排斥，由此吸食到大量血液，從而使蜱體型大大增加?？焖傥能涷珞w重可達吸血前的5～10倍，而硬蜱可高達100倍。在吸血過程中，蜱成功完成病原的傳播，蜱唾液是病原體傳播和建立的主要決定因素。

3.2 蜱唾液腺退化的發生 隨著吸血功能的完成，成蜱唾液腺存在顯著的退化現象，唾液腺在蜱飽血后體積急速變小，多數腺泡出現自溶解。在蜱唾液腺退化同時，蜱通過消化吸收所吸食血液中的營養成分，促進卵巢發育并為產卵做準備。因此，了解蜱唾液腺退化對蜱的防治防控有重要意義。

根據Friesen等[34]在2009年的報道，雌蜱唾液腺退化的先決條件是超過臨界重量，脫離宿主是觸發因素。2008年，L'Amoreaux等[35]揭示了血紅扇頭蜱（Rhinpicephalussanguineus）雄蜱唾液腺退化時的形態特征，如唾液腺分泌物減少且部分存在顆粒性損傷，細胞間的界線變模糊，細胞形狀以及細胞核形態均發生變化，胞質收縮呈空泡狀態。這些變化共同導致細胞破裂釋放凋亡小體。

3.3 蜱的紅細胞消化及鐵離子代謝 在大多數真核生物中，血紅素和鐵的穩態基于血紅素生物合成和血紅素加氧酶介導的動態平衡，自身血紅素的合成主要通過發生在線粒體和胞漿中進化保守的多酶途徑。而蜱缺乏血紅素加氧酶編碼基因，血紅素生物合成途徑不完全。2016年，Perner等[36]發現蜱無法從血紅蛋白衍生的血紅素中獲得生物可利用的鐵，需要吸食宿主血液為外源性血紅素來源，用以繁殖后代。因此，血液和鐵離子的代謝是一個不可忽視的重要抗蜱靶點。

與哺乳動物鐵蛋白主要起儲存鐵功能不同的是，在節肢動物中，鐵蛋白承擔了運輸鐵離子的功能。例如蚊子的鐵蛋白通過血淋巴攜帶鐵離子，然后將鐵傳遞到其他組織。昆蟲鐵蛋白的晶體結構是由12個重鏈和12個輕鏈亞基組成的四面體對稱結構，而哺乳動物鐵蛋白的晶體結構則是由24個重鏈和24個輕鏈亞基組成的八面體對稱結構[37]。2013年，Galay等[38]在長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）體內發現兩種鐵蛋白——HlFer1和HlFer2，這兩種鐵蛋白在蜱體內轉錄及翻譯水平較高，且對于蜱的吸血及成功繁殖有重要影響。蜱吸食血液后，在中腸中消化吸收，部分宿主來源分子穿過腸壁進入血淋巴，在開放體腔中進入唾液腺。蜱通過鐵蛋白轉運來自宿主血液的大量鐵離子。

然而，近年來有研究發現，鐮型扇頭蜱的唾液腺以及唾液中的外泌體中均有與鐵離子消化有關的鐵蛋白，對此現象進一步研究發現鐵蛋白可能參與蜱唾液腺退化過程，并提示蜱唾液腺退化可能有程序性鐵死亡的參與[39]。

3.4 蜱唾液腺退化的分子機制 蜱唾液腺及唾液內容物復雜且多變，2018年，Perner等[40]揭示了蜱唾液內容物隨時間變化而變化，同時指出了單個蜱體內唾液的獨特性。最早在上世紀80年代，有研究人員觀察到蜱的唾液腺退化現象，并發現蛻皮激素在體外實驗中可以誘導蜱唾液腺退化。

在以往的研究中，研究人員認為蜱的唾液腺退化，既不是壞死，也不是病理性，其被認為是蜱體高度精準調控的程序化細胞死亡的生理學過程。在針對節肢動物的研究中，程序化細胞死亡已有一定的研究基礎。在節肢動物中，研究人員以果蠅作為模式生物在節肢動物的細胞程序性死亡上取得了一定的突破。多項針對多種節肢動物的研究顯示，節肢動物中細胞凋亡通路依賴于細胞色素C的介導，例如果蠅中發現的一種細胞色素C基因cyt-c-d參與胱天蛋白酶原（caspase）激活，鱗翅目中一氧化氮誘導的細胞凋亡涉及細胞色素C的釋放[7]。不僅如此，多項研究表明脂類小分子、蛻皮激素等都可以誘導節肢動物細胞的自噬程序性死亡[7]。

目前，隨著科學技術手段的進步，多用組學及差異分析技術在蜱唾液腺退化過程中的應用，證明了細胞程序性死亡是蜱飽血后唾液腺退化的主要機制。2018年，王笑[41]利用iTRAQ定量蛋白質組學技術分析了長角血蜱雌蜱唾液腺退化過程中4個時間點所有蛋白的表達量變化并進行了GO及KEGG通路分析，結果顯示，細胞凋亡通路在唾液腺退化過程中起到重要作用。他們對在節肢動物細胞凋亡通路中起重要作用的細胞色素C、凋亡誘導因子等逐一進行RNA干擾，結果顯示雌蜱飽血體重、產卵量和孵化率等均發生下降。同年，有研究報道，通過對未吸血和飽血后的蜱唾液腺進行轉錄組測序并進行差異分析，對不同吸血時期蜱唾液腺中自噬和凋亡相關的關鍵基因進行動態檢測，對鐮形扇頭蜱（Rhipicephalushaemaphysaloides）中的ATG5同源基因進行鑒定和功能研究，發現蜱唾液腺的退化與細胞自噬和細胞凋亡緊密相關[42]。2020年，Xiao等[43]通過RNA干擾實驗發現促進凋亡的Hippo蛋白在長角血蜱唾液腺退化中發揮作用。同年，Wang等[44]以鐮型扇頭蜱為研究對象，發現參與細胞凋亡的Caspase家族在蜱唾液腺退化中起作用。

2020年，Jia等[45]共同構建了多種蜱的基因組，探索了蜱類常見的血紅素和血紅蛋白消化、鐵代謝、活性氧代謝等遺傳基礎，為針對蜱的研究奠定了基礎。

4 展望

蜱與其他吸血昆蟲不同，其利用唾液腺分泌大量活性分子，逃避宿主識別達到大量吸血的目的，蜱吸食血液后，在中腸中消化吸收，部分宿主來源分子穿過腸壁進入血淋巴，在開放體腔中進入唾液腺，由此在吸血過程中傳播大量病原。Galay等[38]研究證實了蜱體內存在較高轉錄及翻譯水平的鐵蛋白，且對于蜱的吸血及成功繁殖有重要影響[38]。蜱通過鐵蛋白轉運，消化來自宿主血液的大量鐵離子。然而，近年來有研究發現，蜱的唾液腺以及唾液中的外泌體中均有與鐵離子消化有關的鐵蛋白[39]。同時，鐵離子的代謝作為程序性鐵死亡發生機制的一個重要組成部分，由鐵蛋白參與調控。

以上證據引起我們的猜測，近年來新發現的、可能與細胞凋亡存在互作關系的程序性鐵死亡是否參與細胞凋亡占主導的蜱唾液腺退化過程？蜱特有的鐵蛋白是否參與蜱體內的程序性鐵死亡？因此，能否利用程序性鐵死亡機制是否可以作為抗蜱靶點阻斷蜱的吸血過程從而達到阻斷病原傳播過程，還有待進一步研究。