廣益黑豬繁殖性狀的全基因組關聯分析

朱吉，任慧波，吳發平，崔清明，劉瑩瑩，鄧緣，李華麗，胡雄貴，左劍波，鄒億文，陳晨*，彭英林

廣益黑豬繁殖性狀的全基因組關聯分析

朱吉1，任慧波1，吳發平2，崔清明1，劉瑩瑩1，鄧緣1，李華麗1，胡雄貴1，左劍波1，鄒億文3，陳晨1*，彭英林1

(1.湖南省畜牧獸醫研究所，湖南 長沙 410131；2.長沙縣農業農村局，湖南 長沙 410100；3.湖南廣益農業開發集團股份公司，湖南 新化 417600)

選取441頭廣益黑豬經產母豬為研究對象，利用豬50K SNP芯片對豬耳組織DNA進行基因型分型，PLINK 1.9質控后，采用GMAT中的重復力模型進行豬繁殖性狀相關的全基因組關聯分析，確定顯著位點。結果表明：441頭經產廣益黑豬母豬的耳組織DNA基因分型共獲得50 898個SNPs，經質控剩余46 165個SNPs位點用于關聯分析；平均親緣關系系數為–0.002 2，平均親緣關系較遠，不存在明顯的群體分層；總產仔數性狀有1個SNP在全基因組范圍內達到顯著相關，4個SNPs達到潛在顯著關聯，候選基因包括、ENSSSCG00000003753、、；產活仔數性狀有6個SNPs潛在顯著關聯，候選基因包括、ENSSSCG00000022411、、ENSSSCG00000029007、、、ENSSSCG00000023343；弱仔性狀有1個SNP達潛在顯著關聯，候選基因包括和；經基因功能分析推測，可能是影響豬總產仔數的候選基因。

廣益黑豬；繁殖性狀；全基因組關聯分析；SNP；候選基因

提高豬的繁殖性能是其遺傳育種研究的重點和難點之一[1]。大量的研究[2–4]表明，利用常規育種手段提高豬產仔性能的遺傳進展較為緩慢，全基因組關聯分析(GWAS)在動植物遺傳育種上則發揮了重要作用，取得了快速發展。

已有GWAS用于豬總產仔數、產活仔數、排卵率、產死仔數、木乃伊等相關繁殖性狀分析[5–8]。湯香[9]利用50K芯片對寧鄉豬9個繁殖性狀進行GWAS分析，發現32個顯著的SNP位點與總產仔數、死胎數、妊娠周期、成活率和斷乳死亡率等5個繁殖性狀顯著相關，經基因注釋挖掘到15個可能與寧鄉豬繁殖性狀有關的候選基因；進一步的關聯分析結果發現，基因第6外顯子的55 bp處存在T/C突變，TT基因型的總產仔數和產活仔數均顯著高于CC型的。蔡薇等[10]基于50K SNP芯片技術，搜尋到、、是最可能影響金華豬和嵊縣花豬總產仔數和產活仔數的候選基因。宋志芳[11]利用GWAS分析深縣豬繁殖性能，初步推斷、、等12個基因可能是潛在的候選基因。莫家遠等[12]利用GWAS分析，在巴馬香豬上篩選到4個基因(、、、)影響產活仔數。陳俊峰等[13]采用GGP porcine 50K芯片對淮南母豬開展全基因組關聯分析，在總產仔數、有效產仔數、窩重3個繁殖性狀共發現了49個SNPs和64個候選基因，篩出了、、和等作為總產仔數性狀的候選基因。SCHNEIDER等[14]利用全基因組關聯分析豬的死胎性狀，定位到5個QTL，篩選得到候選基因。目前，對培育豬種繁殖性狀的GWAS研究較為鮮見。

廣益黑豬是以湘西黑豬為母本、杜洛克豬為父本，歷經6個世代培育而成的優良新豬種。廣益黑豬綜合體現了中國豬種的早熟多產、耐粗飼、肉質香嫩和外來豬種體型大、生長快、瘦肉率高的特點。為進一步挖掘廣益黑豬的繁殖性能的遺傳潛力，筆者選取了441頭廣益黑豬母豬，利用中芯一號50K SNP芯片開展GWAS分析，篩選主效基因，以期為分子育種手段提升繁殖性能提供依據。

1　材料與方法

1.1　供試廣益黑豬

441頭經產廣益黑豬母豬均來源于湖南廣益農業開發集團股份公司，涵蓋12個家系。所有個體的營養標準一致、飼養環境相同。

1.2　耳組織樣采集及DNA提取

于2021年12月采集414頭母豬的耳組織樣，保存于75%乙醇凍存管，置泡沫箱，交北京康普森公司提取DNA，經質檢合格后用豬中芯一號50K SNP芯片分型并輸出結果成plink格式，以備開展后續分析。

1.3　芯片數據質控和基因型填充

運用PLINK 1.9進行芯片數據質控，刪除掉基因型缺失率>10%、最小等位基因頻率<1%、哈迪–溫伯格平衡檢驗<0.000 001的位點，質控后運用Beagle5.0基因型填充[15]。

1.4　全基因組關聯分析模型

運用PLINK 1.9計算廣益黑豬群體的主成分矩陣(PCA)、親緣系數矩陣，并運用GMAT進行重復力模型GWAS分析。模型如下：

=++++

其中，為表型向量；為固定效應的設計矩陣；為固定效應向量，包括胎次和年份效應；為檢驗標記效應的設計矩陣；為檢驗標記效應向量；為多基因效應向量，服從正態分布(0,2)，為標記推斷的親緣關系矩陣，2為多基因效應的方差；為永久環境效應向量，服從正態分布(0,σ2)，為單位矩陣，σ2為永久環境效應的方差；為殘差效應向量，服從正態分布(0,2)，2為殘差方差。采用1/作為全基因組顯著閾值，5/作為潛在顯著性閾值，其中，為有效SNP位點數。

1.5　候選基因注釋

針對顯著SNP位點的名稱和所在基因組位置，運用ANNOVAR，參照豬基因組序列版本(Sus scrofa 10.2)，在其上下游進行基因注釋。

1.6　富集分析

運用R包clusterProfiler，對注釋候選基因進行GO和KEGG功能富集分析。采用R語言的enrich plot包進行可視化繪圖。結合文獻查閱、綜合分析，確定生豬繁殖性狀候選基因。

2　結果與分析

2.1　供試廣益黑豬的表型數據分析結果

供試廣益黑豬的總產仔數、產活仔數、弱仔數、死胎數等繁殖性狀列于表1。從表1可看出，每窩總產仔數、產活仔數、死胎數、弱仔數的平均值分別為9.91、9.36、0.22、0.24頭，變異系數分別為19.86%、23.50%、282.96%、286.06%。該結果表明廣益黑豬繁殖性狀的變異系數較高，具有較大的遺傳改良潛力。

總產仔數數據為722窩樣本統計所得；產活仔數、死胎數、弱仔數數據為436窩樣本統計所得。

2.2　供試廣益黑豬的基因分型及數據質控

基因分型后共獲得50 898個SNPs。質控時，剔除SNP缺失率>10%的位點531個、最小等位基因頻率<1%的位點3891個、哈迪–溫伯格平衡檢驗<0.000 001的位點311個，剩余46 165個SNPs位點用于后續關聯分析。

2.3　供試廣益黑豬的群體結構分析結果

圖1體現的是豬只之間的親緣關系遠近，414頭廣益黑豬母豬的平均親緣關系系數為–0.002 2，最小值為–0.211 3，最大值為0.829 9，平均親緣關系較遠。從圖2可看出，供試廣益黑豬群體不存在明顯的群體分層。

圖1　供試廣益黑豬的親緣關系矩陣熱圖

圖2　供試廣益黑豬PCA的群體結構

2.4　供試廣益黑豬的全基因組關聯分析結果

從圖3可看出，4個圖中值的觀測與期望值均顯示出強烈偏差，提示與性狀顯著關聯的SNP可能會比預期多。

a　總產仔數；b　產活仔數；c　死胎數；d　弱仔數。

從圖4可看出，總產仔數、產活仔數、弱仔等3個性狀均檢測到SNPs達到全基因組顯著或潛在顯著水平，死胎性狀未檢測到達全基因組潛在顯著水平的SNP；總產仔數的顯著或潛在顯著水平的SNPs位于6和12號染色體上，產活仔數的潛在顯著水平的SNPs位于6和13號染色體上，弱仔的潛在顯著水平的SNPs位于13號染色體上。

從表2可知，3個性狀共計有12個SNPs達到全基因組潛在顯著水平，關聯基因13個。與總產仔數顯著關聯的SNP有1個，位于6號染色體上，與總產仔數潛在顯著關聯的SNPs有4個，分別位于6號和12號染色體上。6號染色體上的1個顯著SNP(CNC10062413)、1個潛在顯著SNP(CNC10062410)處于1個未知功能片段和基因之間的位置，1個潛在顯著SNP(CNC10062432)處于和ENSSSCG00000003753基因之間的位置；12號染色體的2個潛在顯著SNPs(CNC10120322、CNC10120325)分別處于、的內含子上。與產活仔數潛在顯著關聯的SNPs有6個，分別位于6號和13號染色體上。6號染色體上的2個潛在顯著SNPs(CNC10061224、CNC10061225)處于和ENSSSCG00000022411基因之間的位置，1個潛在顯著SNP(CNC10061169)處于和ENSSSCG00000029007基因之間的位置，2個潛在顯著SNPs(CNC10061151、CNC10061152)處于和基因之間的位置；13號染色體的1個潛在顯著SNP(CNC10130001)處于1個未知功能片段和ENSSSCG00000023343基因之間的位置。與弱仔潛在顯著關聯的SNP有1個，位于13號染色體上，處于和基因之間的位置。

a　總產仔數；b　產活仔數；c　死胎數；d　弱仔數。虛線水平線為全基因組顯著關聯閾值線(1/n)；實線水平線為全基因組水平潛在顯著閾值線(5/n)。

表2　供試廣益黑豬繁殖性狀全基因組關聯顯著的SNPs和相關基因

“*”示SNP與性狀顯著關聯。

2.5　GO和KEEG富集分析結果

GO和KEGG富集分析結果(表3和表4)表明，總產仔數相關基因主要在磷酸轉移酶活性、磷脂酰肌醇介導的信號、胞質分裂的調控、胞質運輸等方面起作用，并參與磷酸肌醇代謝、磷脂酰肌醇信號系統、自體吞噬等；主要在p38–MAPK級聯、應激激活MAPK級聯反應的正向調節、血管新生的細胞遷移調控、細胞核因子酉乙蛋白信號的正調控、細胞衰老的負調控起作用，并在下丘腦分泌促性腺激素釋放激素信號通路、神經營養素信號通路、MAPK信號通路等富集。產活仔數相關基因主要在造血祖細胞分化、血細胞生成、造血或淋巴器官發育等生物學進程富集。弱仔相關基因主要在細胞緊密連接、趨化因子信號通路、Rap1信號通路、肌動蛋白骨架調節、環磷腺苷信號通路、Ras信號通路等富集。

表3　供試廣益黑豬注釋候選基因的GO富集分析結果

表4　供試廣益黑豬注釋候選基因的KEGG富集分析結果

3　結論與討論

本研究中，與總產仔數顯著關聯的SNP關聯的候選基因，也名為34，是唯一一個第3類磷脂酰肌醇3–激酶(PI3K)，在自噬、細胞內吞、Mtor/S6K1信號通路、內吞體–高爾基體膜運輸等生物過程中起著重要調節作用[16]。以往研究[17–18]發現，在小鼠神經、肝臟、心臟等多個組織器

官的正常生理功能起重要作用，小鼠胚胎急性刪除成纖維細胞后，會導致內吞作用受阻，自噬退化。孫妍[19]研究發現，可能通過自噬、內吞等生物過程的介導，對小鼠的卵母細胞發育起重要作用。通過有效激活包含JNK、p38、ERK5在內的MAPKs、NF–κB信號通路，調控胚胎心血管的早期發育、肌細胞形成、炎癥和免疫應答等[20]。YANG等[21]在小鼠上發現MEKK3(有絲分裂原活化蛋白激酶)，MAP3K家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在小鼠的早期胚胎發育中有著至關重要的作用，敲除可造成小鼠早期胚胎因血管發育不全以及卵黃囊結構破損而死亡。另有研究表明，ERK信號通路參與正常妊娠的維持，在羊的子宮動脈收縮力的調節中發揮重要作用[22]；p38–MAPK活化會導致人胎兒組織發生衰老和早衰[23]；對小鼠胚胎血管生成至關重要，并且在胚胎血管發育中發揮內在作用[24]。HWANG等[25]研究顯示，的mRNA表達量與產仔數呈負相關；同一SNP，也被報道與德國大白豬的產活仔數有關[26]。綜合分析可知，基因可能是總產仔數的重要候選基因。

與產活仔數潛在顯著關聯的SNP鄰近的，屬于鋅指蛋白家族，對其研究較少，僅局限于基因結構、轉錄調控等信息的研究[27]。鋅指蛋白在生物體內分布廣泛，作為轉錄調控因子，在基因表達調控、細胞分化、胚胎發育等方面發揮著重要的作用[28]?；蛴锌赡苁秦i產活仔數相關的候選基因，仍需進一步驗證。

與弱仔數潛在顯著關聯的SNP關聯的候選基因，調節細胞骨架重組、基因轉錄、細胞遷移和黏附、細胞增殖凋亡等過程[29]?，F有的研究基本圍繞其“促癌基因”特性開展的[30]。本研究結果的基因富集結果顯示，在Rap1信號通路和Ras信號通路富集。Rap1是一種小GTP酶，以高度依賴細胞類型的方式調節MAP激酶(MAPK)活性。Ras蛋白是GTP酶，激活的RAS(RAS–GTP)通過效應因子調節PI3K活性。這與相關研究[31]的與MAPK/P38信號通路相關、磷酸化后可間接激活MAPK/Erk信號通路的結果相印證，也提示了該基因作為繁殖性狀相關基因的可能，后續應進一步驗證。

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Genome-wide association study of reproductive traits in Guangyi black pigs

ZHU Ji1，REN Huibo1，WU Faping2，CUI Qingming1，LIU Yingying1，DENG Yuan1，LI Huali1，HU Xionggui1，ZUO Jianbo1，ZOU Yiwen3，CHEN Chen1*，PENG Yinglin1*

(1.Hunan Institute of Animal and Veterinary Science, Changsha, Hunan 410131, China; 2.Changsha County Agricultural and Rural Bureau, Changsha, Hunan 410100，China; 3.Hunan Guangyi Agricultural Development Corporation, Xinhua, Hunan 417600, China)

This experiment involved the collection of ear tissue samples from 441 multiparous sows of Guangyi black pigs. DNA was extracted and genotyped using a porcine 50K SNP beadchip. Quality control(QC) was performed using PLINK 1.9 software. Genome-wide association analysis of porcine reproductive traits was conducted based on QC results using the mixed linear model of GMAT. Results revealed that among 414 Guangyi black sows, a total of 50 898 SNPs were obtained, but after quality control, 46 165 SNPs remained suitable for GWAS. The population’s kinship coefficient was –0.002 2, indicating a relatively low average genetic relationship and negligible population stratification. One SNP exhibited significant correlation, and four SNPs showed potential significant correlation with total number born at a genome-wide level. The associated candidate genes included, ENSSSCG00000003753,and. Additionally, six SNPs potentially displayed significant correlation with the number born alive, involving associated candidate genes such as, ENSSSCG00000022411,, ENSSSCG00000029007,,and ENSSSCG00000023343. Furthermore, one SNP showed potential significant correlation with the number born weak, and the associated candidate genes wereand. Gene functional analysis suggested thatandmight be candidate genes influencing the total number born in Guangyi black pigs.

Guangyi black pigs; reproductive traits; genome-wide association analysis; SNP; candidate gene

S828.2

A

1007–1032(2023)04–0453–08

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.012

2023–01–06

2023–08–06

湖南省自然科學基金項目(2021JJ30386)；湖南省重點研發計劃項目(2021NK1009、2020NK2024、2019NK2193)；湖南省重點實驗室開放研究基金項目(2017TP1030)

朱吉(1981—)，女，湖南望城人，碩士，副研究員，主要從事豬的遺傳育種研究，24625546@qq.com；*通信作者，陳晨，博士，副研究員，主要從事豬的遺傳育種研究，404071654@qq.com

朱吉，任慧波，吳發平，崔清明，劉瑩瑩，鄧緣，李華麗，胡雄貴，左劍波，鄒億文，陳晨，彭英林．廣益黑豬繁殖性狀的全基因組關聯分析[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：453–460．

ZHU J，REN H B，WU F P，CUI Q M，LIU Y Y，DENG Y，LI H L，HU X G，ZUO J B，ZOU Y W，CHEN C，PENG Y L．Genome-wide association study of reproductive traits in Guangyi black pigs[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：453–460．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正