重組人源化膠原蛋白促進創面修復研究及其醫用敷料應用

何杜鵑，馬旭*，劉盛，徐劍南，毛小華

（1.長沙聚源醫療科技有限公司，湖南瀏陽 410300；2.浙江諸暨聚源生物技術有限公司杭州分公司，浙江杭州 310051）

膠原蛋白由三條左旋多肽α-鏈纏繞而成，是細胞外基質的主要成分。近年來，隨著膠原蛋白提取制備技術的發展，市場發展迅速，2022 年全球膠原蛋白市場規模為91 億美元，預計從2023 年到2030 年將以10.2%的復合年增長率（CAGR）增長[1]。其中，天然膠原占比相對較大，是從動物組織、皮膚提取物獲取，但其具有免疫原性、病毒傳播等風險，加工性弱，限制開發[2-6]。重組膠原是由基因工程菌制備，無病毒隱患、生物相容性高、水溶性優良，被廣泛用于組織工程、生物醫學、藥物釋放等領域[7-9]。據統計，2021 年我國重組膠原市場規模已達到108 億元，預計2027 年將擴增至千億。近年來，國家市場監督管理總局陸續發布文件，鼓勵重組膠原產業創新和高質量發展[10-12]。國內膠原企業已突破重組膠原生產技術瓶頸，可實現規?；a[13-14]。本研究選用江蘇江山聚源生物技術有限公司生產的重組人源化膠原蛋白開展細胞、動物功效研究和透皮研究，以貼敷料產品開展醫用敷料性能和生物安全性研究，同時收集已有重組膠原蛋白醫用敷料臨床文獻，評估該原料制備醫用敷料的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

重組人源化膠原蛋白（分子量為55 000 Da），江蘇江山聚源生物技術有限公司；硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基、L-929 小鼠成纖維細胞系，美國菌種保存中心（ATCC）；新西蘭兔、豚鼠（天竺鼠），無錫恒泰實驗動物養殖有限公司；二月齡大白豬、磷酸鹽緩沖液（PBS）、角質形成細胞，廣東博溪生物科技有限公司；CLM-170B-8-NF CO2培養箱，新加坡ESCO 公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；PHS-3C pH 計，上海儀電科學儀器股份公司；KDN-19H 自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；Permergear 擴散池，世聯博研（北京）科技有限公司。

1.2 重組人源化膠原蛋白促進創面修復研究試驗

1.2.1 細胞試驗

開展重組人源化膠原蛋白（RHC）對成纖維細胞和表皮細胞的促細胞增殖、遷移試驗[15]。

1.2.1.1 促細胞增殖試驗

取生長良好細胞制成單細胞懸浮液并統計數量，使細胞密度為104個/mL，接種于96 孔板，每孔加入200μL 細胞懸浮液，待細胞貼壁后，加入待測樣品（濃度為0.01%、0.05%、0.10%），每個樣品設置9 個復孔，放置在37 ℃和5% CO2培養箱中連續孵育48 h 后移除培養基，每孔用200 μL PBS 清洗。去除洗滌液后，向30 mL 培養基中添加15 mg 噻唑藍（MTT）制備MTT-培養基溶液，向每個培養孔中加入200 μL MTT-培養基溶液，然后在37 ℃和5% CO2條件下培養3 h?？焖俜D培養板，棄去上清液，向每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使MTT藍紫色結晶完全溶解。用酶聯檢測儀檢測各孔在490 nm 處的吸光值（OD490值），同時設置無細胞孔作為對照組進行調零，取6 孔平均值。

1.2.1.2 細胞遷移試驗

細胞鋪板：先用記號筆在6 孔板背后用直尺均勻劃橫線，每隔0.5 ～1.0 cm 一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3 條線。在孔中加入約5×105個細胞，具體數量因細胞不同而異，基本為過夜能鋪滿。劃痕實驗：第2 天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS 清洗細胞3 次，去除劃下的細胞，以不加入藥物的無血清培養基為對照組，加入待測樣品為實驗組，終濃度為0.01%、0.05%和0.10%，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養。按0 h 和24 h 取樣，拍照。用ImageJ-win 64 軟件測量劃痕面積并計算每組的細胞遷移速率。細胞遷移速率=固定劃痕區移行細胞的總面積/初始劃痕區面積×100%。

1.2.2 豚鼠濕疹模型試驗

選用豚鼠模型，利用2,4-二硝基氯苯（DNCB）一次性大劑量致敏，多次小劑量激發的方法誘發豚鼠濕疹皮炎模型[16]。選用豚鼠70 只，隨機分為5 組（每組14 只，考慮試驗操作成功率，實際8 只），包括致敏模型組4 組和空白對照組（無致敏操作），其中3 組致敏模型當天涂抹給藥，分別給予1%重組人源化膠原蛋白（RHC）100 μL、200 μL 以及400 μL，致敏模型空白組和空白對照組給予同等溶劑（0.9%氯化鈉注射劑）。每日給藥1 次，連續給藥30 d，研究5 個實驗組病理學變化。

評判標準：試驗組、模型組和對照組末次給藥后2 h 處死豚鼠，耳朵處打孔取材制作切片，進行常規病理學檢測并觀察其組織學改變，對表皮增厚、角化過度、血管擴張、內皮腫脹和間質水腫情況進行評分，根據嚴重情況評分（0 ～2 分），將這些指標評分相加（8只實驗動物評分）后進行數據統計，使用SPSS 25.0 進行統計學分析。

1.3 重組人源化膠原蛋白醫用敷料應用研究試驗

1.3.1 重組人源化膠原蛋白修護貼敷料制備

取純化水溶解攪拌卡波姆；加純化水溶解羥苯甲脂、乙二胺四乙酸二鈉和甘油（需加熱）；冷卻后，合并上述兩種溶液，再加入純化水預溶的三乙醇胺和重組人源化膠原蛋白，攪拌均勻定容，灌裝，滅菌。

1.3.2 完整和淺表創口透皮吸收試驗

測試方法依據《化學品 皮膚吸收 體外試驗方法》（GB/T 27818—2011）[17]。供試完整皮膚選用2 月齡大白豬腹部皮膚，去除脂肪和毛發組織，生理鹽水浸泡后常溫保存備用。上述完整皮膚用手術刀制造5 mm 長度的淺表創口作為淺表創口皮膚，用生理鹽水浸泡，常溫保存備用。

擴散池：15 mL；接收池：50 mL，液體均為pH 7.0 的PBS 緩沖溶液；實驗組分別配制0.05%、0.10%、0.50%、1.00%的重組人源化膠原蛋白開展試驗。

1.3.3 基本性能檢測

取上述修護貼敷料，依據《重組膠原》（YY/T 1849—2022）[12]和《中華人民共和國藥典（2020 版）》[18]檢驗方法開展外觀（目視、手感、鼻嗅）、pH 值和總蛋白含量的檢測。

1.3.4 生物學試驗

按照GB/T 16886.1—2022[19]要求，根據貼敷料預期和人體表皮短期接觸開展體外細胞毒性[20]。開展細胞毒性利用MEM 培養基于37 ℃條件下浸提樣品24 h，取樣品終濃度100%、75%、50%、25%開展試驗，同時設置陰性（高密度聚乙烯處理）和陽性（二乙基二硫代氨基甲酸鋅處理）對照組以及皮膚刺激[21]和皮膚致敏試驗[21]，驗證修護貼敷料的生物相容性。

1.4 重組膠原蛋白敷料臨床應用

通過檢索數據庫，如中國期刊全文數據庫、萬方數據庫、維普數據庫（1999—2023 年），收集相關重組膠原臨床應用文獻匯總統計相關數據。

2 結果與分析

2.1 重組人源化膠原蛋白促進創面修復研究

2.1.1 重組人源化膠原蛋白對細胞生長和遷移的促進作用

膠原蛋白及其衍生片段調控許多細胞功能，如細胞形狀維持，細胞分化、遷移和許多蛋白質的合成[22]，在創面愈合過程中刺激細胞活性，吸引細胞定向遷移到傷口部位促進新膠原基質的沉積等[23]。李濱等[15]研究發現，重組膠原蛋白（2 000 Da）能明顯促進細胞（成纖維細胞和表皮細胞）生長和細胞遷移，起效濃度為0.002 5%。本次試驗選用重組人源化膠原蛋白（55 000 Da），開展對表皮細胞和成纖維細胞的生長促進和劃痕試驗細胞遷移研究，見圖1 和圖2?？梢钥闯?，敷料常用濃度（0.01%～0.10%）均能促進細胞生長活性和細胞遷移，重組人源化膠原蛋白對表皮細胞生長活性和細胞遷移的促進作用明顯，且具有一定的濃度依賴性。

圖2 細胞在不同重組人源化膠原蛋白濃度的遷移速率

2.1.2 重組人源化膠原蛋白對DNCB 所致豚鼠濕疹皮炎的修復作用

濕疹皮炎包含濕疹、脂溢性皮炎、接觸性皮炎等，會嚴重影響患者工作生活。豚鼠試驗組病理學切片評分統計結果見圖3，可見皮炎模型組耳部評分（9.00 分）顯著高于空白對照組（3.13 分）（P＜0.01）。病理切片光學顯微鏡觀察結果見圖4，模型對照組皮膚組織病灶區表皮顯著增生，皮膚附屬器減少，分布欠均勻，乳頭層血管增生伴炎癥細胞浸潤；重組人源化膠原蛋白3個劑量實驗組耳部組織表皮完整伴輕度角化，局灶區表皮輕度增生，真皮層膠原纖維排列有序，皮膚附屬器分布正常，乳頭層血管輕度增生，未見明顯炎癥細胞浸潤。重組人源化膠原蛋白400 μL 實驗組病理學組織評分顯著低于模型組，表明重組人源化膠原能有效改善濕疹皮炎損傷后耳部皮膚的病理學變化。

圖3 重組人源化膠原蛋白對濕疹皮炎豚鼠耳朵皮膚影響的病理學評分

圖4 不同組別的濕疹皮炎豚鼠耳朵皮膚病理學結果（HE 染色）

2.2 重組人源化膠原蛋白醫用敷料應用研究

2.2.1 重組人源化膠原蛋白（RHC）透皮試驗結果

收集相應時間點的接收液利用高效液相色譜檢測重組人源化膠原蛋白，采用面積歸一法計算。結果發現重組人源化膠原蛋白（0.05%、0.10%、0.50%以及1.00%實驗組）在24 h 內未出現透皮吸收現象。淺表創面透皮試驗發現，1.00%重組人源化膠原蛋白在24 h 內未出現創面透皮吸收現象（表1）。重組膠原蛋白在基因構建時，可通過控制氨基酸含量控制重組膠原蛋白的分子量。本研究所用重組膠原分子量為55 000 Da[24]，表皮非慢性創面敷料應用時，不會被人體吸收，符合Ⅱ類醫用敷料應用基本要求。

表1 重組人源化膠原蛋白24 h 皮膚透皮量（單位：mg/L)

2.2.2 重組人源化膠原蛋白修護貼敷料基本性能

對重組人源化膠原蛋白修護貼敷料開展外觀、pH 值、總蛋白含量的基本性能檢測，結果見表2。外觀檢測結果證明選用膜布和藥物輔料原料，在潔凈車間生產，終端滅菌后產品可達到外觀要求；pH 值滿足產品預期人體表皮使用要求（表皮pH 為4.0 ～7.5）[25]；總蛋白含量根據原料對比研究氮轉化蛋白系數，降低非蛋白氮誤差，可確保對產品含量的把控。

表2 重組人源化膠原蛋白修護貼敷料基本性能檢測結果

2.2.3 重組人源化膠原蛋白修護貼敷料生物學性能

觀察重組人源化膠原蛋白修護貼敷料樣品浸提液對L-929 細胞形態的影響，發現無負面影響，細胞培養良好；細胞毒性生物學定量檢測結果如圖5，實驗組細胞活性數值和陽性對照組均存在顯著差異（P＜0.01），其中100%樣品浸提液組在孵育細胞24 h 后細胞形態基本完好，細胞活力值為73.99%，證明無細胞毒性。皮膚刺激試驗過程中動物未出現異常癥狀或死亡，樣品對皮膚無刺激作用。皮膚致敏試驗中，動物皮膚完好，未出現紅斑和水腫反應，樣品不會引起皮膚致敏反應。上述試驗結果均證明重組人源化膠原蛋白修護貼敷料醫用敷料應用能滿足醫療器械生物相容性要求。

圖5 重組人源化膠原蛋白修護貼敷料MTT 細胞毒性檢測結果

2.3 重組膠原蛋白臨床應用

根據《重組膠原生物材料命名指導原則》，重組膠原蛋白醫用敷料產品名稱中的核心詞根據重組膠原蛋白制備基因片段的來源不同，主要分為“重組人膠原蛋白”“重組人源化膠原”和“重組類膠原蛋白”[11]；根據對已上市產品收集，醫用敷料名稱特征詞也包含“酵母重組膠原”“類人膠原蛋白”等。根據上述關鍵詞組合篩選數據庫獲取到臨床應用文獻共計40 余篇，涵蓋不同品類和用途，見圖6。其中貼敷料產品臨床應用最早，占比最多（56.25%）；皮炎以及術后修復、皮膚屏障的應用最多。通過文獻查閱信息收集發現重組膠原蛋白醫用敷料臨床應用均無不良反應反饋，重組膠原聯合激光等術后應用均展現良好的相容性，能緩解術后疼痛，促進創面恢復，皮膚屏障功能修復效果良好[26-29]。重組人源化膠原蛋白滿足行業標準《重組膠原》（YY/T 1849—2022）要求。

圖6 重組膠原蛋白臨床應用文獻產品品類及應用分布情況

3 討論與結論

皮膚具有致密的“磚墻結構”，是化學物質透皮吸收的主要屏障，一般只允許水、電解質等結構簡單的小分子物質通過[30]。研究人員通過酶解膠原擴散池試驗發現，膠原蛋白肽分子質量越大，透皮吸收能力越小[31-32]；本研究選用豬腹皮膚[33]發現重組人源化膠原蛋白在皮膚表層短暫（＜24 h）使用時，不會透皮吸收，進入血液，不參與人體內循環。表皮細胞和成纖維細胞的促生長和遷移試驗結果證明重組人源化膠原在細胞層面發揮結構和功能作用；豚鼠動物模型試驗切片能直觀分析重組人源化膠原蛋白對病理變化的影響。修護貼敷料性能和生物學評價滿足敷料產品基本使用要求。臨床文獻發現，重組人源化膠原含量≥0.1 mg/mL 可抑制和緩解皮炎、敏感性肌膚、痤瘡、激光治療后等各種原因引起的皮膚炎癥反應，促進創面愈合與皮膚修復，縮短病程[34-35]。重組人源化膠原（55 000 Da）在醫用Ⅱ類表皮接觸敷料的應用可大力開發。