乙腈中黃曲霉毒素B1 溶液標準物質的研制及不確定度評估

王興龍，劉少穎，諸寅，倪曉峰，蔡強*

（1.浙江清華長三角研究院，浙江嘉興 314000；2.杭州市疾病預防控制中心，浙江杭州 310000）

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）主要是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（A. parasiticus）等多種真菌產生的次生代謝產物，是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。從國內外部分地區AFTB1污染狀況及膳食暴露風險評估中發現，雖然總體污染水平不高[1-3]，但是黃曲霉毒素有顯著的慢性毒性，攝入大劑量AFTB1后會對氧化、遺傳、肝臟系統造成一定程度的損傷[4-5]。目前不同國家和地區對黃曲霉毒素檢測種類和限值要求均不同，例如我國《食品安全國家標準 食品中真菌毒素含量》（GB 2761—2017）中對AFTB1有限量要求，歐盟除規定了AFTB1的限量外，還規定了4 種黃曲霉毒素總和的限量要求。真菌毒素標準物質，無論從品種上還是從數量上都無法滿足國際互認和量值比對的溯源需要，因此有必要開展系統的AFTB1標準物質的研制工作，對于保證食品中AFTB1監測檢測及風險評估數據一致性評價具有重要意義。

根據標準物質量值的溯源性、準確度、精密度等技術指標，本研究采用高效液相色譜串聯高分辨質譜法、紫外-可見光譜法對AFTB1進行表征與鑒定。通過使用滿足計量學特性要求的測量方法和計量器具，采用了8家實驗室聯合定值，同時考察了其均勻性、穩定性，并系統地評估了在研制過程引入的不確定度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；QE高分辨液質聯用儀，美國Thermo Scientific 公司；Lambda 35 紫外-可見分光光度計，美國PerkinElmer公司；XSE105DU 電子天平，美國Mettler Toledo 公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore 公司。

黃曲霉毒素B1標準溶液（GBW 10174），中國計量科學研究院；黃曲霉毒素B1固體粉末（純度99%以上），以色列Fermentek 公司；乙腈，色譜純，德國默克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準物質候選物選擇

為了進一步確認原料（黃曲霉毒素B1固體粉末）的準確可靠，分別采用高分辨質譜法、紫外分光光度法對購買的原料進行了主成分定性分析。將經過主成分定性分析的標準物質原料，采用重量-容量法配制標準物質溶液[6]。黃曲霉毒素B1在乙腈中相對穩定[7]，因此選擇適量乙腈，將9.97 mg AFTB1固體充分溶解，將冷卻后的溶液沿玻璃棒小心轉入2 000 mL 的容量瓶中，定容至刻度。分裝至5 mL 潔凈干燥器的棕色安瓿瓶中，每個包裝量為4 mL，將安瓿瓶快速熔封，共分裝474 個包裝單元，置于-18 ℃冰箱內保存。AFTB1原料充足，滿足復制的要求。

1.2.2 定性分析

（1）高效液相色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A 為超純水，B 為乙腈-甲醇溶液（體積比1 ∶1）；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；等度洗脫。

（2）高分辨質譜條件

NCE：30/50/70；模式：Full MS/ddMS2，Full MS分辨率為70 000，dd MS2分辨率為17 500；離子源模式為ESI+。

（3）紫外-可見光譜分析

采用紫外-可見光譜分析法測定配制好的AFTB1溶液標準物質，波長掃描范圍為200 ～450 nm，分析化合物紫外可見光吸收光譜。

1.2.3 高效液相色譜-紫外檢測法定量分析

色譜柱：XTerra RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇溶液（50+50）；柱溫35 ℃；進樣體積：10 μL；紫外檢測器：檢測波長為359 nm；標準溶液及待測溶液直接進樣，外標法單點定值。梯度洗脫0 ～1 min，B 相30%；1 ～7 min，B 相變化至90%；7 ～9 min，B 相保持100%；9 ～13 min，B 相保持30%。

1.2.4均勻性檢驗

根據《標準物質的定值及均勻性、穩定性評估》（JJF 1343—2022）[8]，對標準物質進行均勻性研究。采用簡單隨機抽取方式，抽取15 瓶樣品，按照1.2.3 確定的分析方法，每一瓶抽取3 份子樣進行測定，最小取樣量為10 μL。采用單因素方差分析法（F檢驗法）對檢測數據進行統計分析[9]，判斷標準物質的均勻性。

1.2.5穩定性考察

穩定性是所有標準物質的關鍵特征之一，通常評估樣品短期穩定性和長期穩定性。短期穩定性評估采用同步穩定性評估方法，將制備好的溶液標準物質統一保存在60 ℃條件下，分別在第0 天、第1 天、第3 天、第5 天、第7 天取2 份樣品于-18 ℃下保存，所有取出的樣品平行測定2 次。長期穩定性評估，在-18 ℃條件下，分別于第0 個月、第1 個月、第3 個月、第6 個月每個時間點取2 個樣品，每個樣品平行測定3 次。以監測時間和監測結果擬合直線，采用趨勢分析法對結果進行統計分析[10]。

1.2.6標準物質的定值

本溶液標準物質采用8 家實驗室間聯合定值。為確保定值過程中的可溯源性與質量控制，在定值過程中將標準物質溶液直接與一級有證標準物質溶液GBW 10174 比對，單點外標法定值。向每家定值單位發放2 個包裝的AFTB1溶液標準物質（包裝1、包裝2），每個包裝平行測定6 次，提供12 個測定結果。數據經過正態分布檢驗、組內可疑值檢驗、組間數據精度檢驗后，將有效數據匯總，計算總平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 高分辨質譜定性分析

將AFTB1溶液標準物質用20%乙腈水溶液逐級稀釋至100 ng/mL，按照1.2.2 項方法進行測試，測定結果見圖1。得出的AFTB1質荷比為313.069 64，AFTB1理論質荷比為313.070 66[11]。按照高分辨質譜的判定原則，兩者基本符合。AFTB1主要碎片離子285.1、241.0，與國家標準GB 5009.22—2016[12]相一致。由此可以判定，溶液中的主成分為AFTB1。

圖1 黃曲霉毒素B1 的高分辨質譜圖

2.2 紫外光譜分析定性研究

AFTB1化合物在乙腈中的紫外-可見光譜如圖2所示，在223 nm，264 nm 和359 nm 波段左右處，存在最大吸收，與RODRICKS[13]報道的AFTB1在甲醇中的最大吸收波段（223 nm、265 nm 和361 nm）基本一致，初步鑒定化合物為AFTB1。

圖2 乙腈中黃曲霉毒素B1 的紫外光譜

2.3 均勻性檢驗及最小取樣量的確定

對隨機抽取的15 個樣本中黃曲霉毒素B1實測數據采用F檢驗進行統計分析，通過組間方差和組內方差的比較判斷各組測量值之間有無系統誤差。查表得F（0.05,14,30）=2.037，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1成分分析標準物質均勻性數據的F計算值為1.145，小于F（0.05,14,30）=2.037，說明在95%的置信區間內，乙腈中黃曲霉毒素B1分布均勻，同時確定最小取樣量為10 μL。

2.4 穩定性檢驗

短期穩定性是評估運輸過程對標準物質量值的影響。在95%置信水平下進行短期穩定性評估，發現乙腈中黃曲霉毒素B1測定值隨時間變化的擬合直線斜率為|β1|=0.000 244，斜率標準偏差S(β1)=0.001 141，t0.95,3=3.18，|β1|＜t0.095,3·S(β1)。說明60 ℃條件下，乙腈中黃曲霉毒素在7 d 內是穩定的。

長期穩定性數據以平均值歸一化后，其結果見圖3。虛線內的兩條黑實線代表乙腈中黃曲霉毒素B1隨時間變化的不確定度。在95%置信水平下，乙腈中黃曲霉毒素B1測定值隨月份變化的擬合直線斜率為|β1|=0.000 714 286，斜率標準偏差S(β1)=0.001 649 572，t0.95,3=4.30，|β1|＜t0.095,3·S(β1)。乙腈中黃曲霉毒素B1溶液標準物質在-18 ℃條件下儲存至少6個月內穩定?；谮厔莘治?，可將貨架期延長至24 個月，以此來評估長期穩定性引入的不確定度[14]。

圖3 乙腈中黃曲霉毒素B1 長期穩定性歸一化結果

2.5 聯合定值的結果

本次定值共有8 家單位（A、B、C、D、E、F、G、H）參與，均參考1.2.3 確定的方法進行測定，詳見表1。根據達戈斯提諾（D’Agostioon）法檢驗數據的正態性。統計量Y=1.49，位于-3.61 ～1.59（p=0.99），故接受所有數據為正態分布；經格拉布斯（Grubbs）法檢驗，所有參與定值實驗室的每組數據中|v1|均＜λ（0.05,12）·s，無可疑值需要剔除；經科克倫（Cochran）法檢驗，科克倫檢驗結果C 為0.160，小于C（0.05,8,12）=0.275，說明各組間數據等精密度。

表1 聯合實驗室定值結果

因此，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1定值結果為8家實驗室測定結果的總平均值，即4.99 μg/mL。

2.6 不確定度評定

根據相關文獻及技術規范[8]，確定了影響乙腈中黃曲霉素毒素B1測定結果的各個不確定度分量，主要包括：標準物質的均勻性引起的不確定度u(bb)；標準物質的穩定性引起的不確定度；標準物質的定值過程帶來的A 類不確定度和B 類不確定度。

2.6.1 均勻性引入的不確定度

根據均勻性測定結果，由均勻性引入的不確定度可按式（1）表示[6]。

式中：S2為組內方差；n為組內測量次數，n=3；vs為組內自由度，Vs=30。

均勻性檢驗過程中，15 個樣本，3 平行，45 個數據的均值為5.04。則由均勻性檢驗引入的相對不確定度為

2.6.2 穩定性引入的不確定度

由穩定性引入的不確定度可按式（2）表示[15]。

式中：s(β1)為回歸分析斜率的標準偏差；X為穩定性評估的時間。

短期穩定性考察時，14 個樣本的平均值為4.997 μg/mL；長期穩定性考察時，12 個樣本的平均值為5.003 μg/mL。則由短期穩定性引入的相對不確定度為

由長期穩定性引入的相對不確定度為

2.6.3 定值過程引入的不確定度

定值過程引入的A 類不確定度按式（3）計算[16]。

式中：s為各實驗室定值結果平均值的標準偏差；n為實驗室個數。

則由定值過程引入的A 類相對不確定度為

定值過程引入的B 類不確定度由標準溶液不確定引入，根據GWB 10174 標準物質證書規定，標準溶液的相對擴展不確定為2%（k=2），則由定值過程引入的B 類相對不確定度為uBrel=2%/2=1%。

2.7 不確定度的合成

通過以上分析，將各分量合成總相對不確定度：

當k=2 時，相對擴展不確定度Urel=k×urel=2×1.302%=2.604%，則擴展不確定度。

因此，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1成分分析標準物質特性值表示為（4.99±0.13）μg/mL（k=2）。

3 結論

本文制備的黃曲霉毒素溶液標準物質，經均勻性、穩定性考察，結果無顯著性變化。對黃曲霉毒素B1的量值進行不確定度評定，發現影響不確定度的主要因素為均勻性、穩定性及定值過程相關的A 類不確定度與B 類不確定度。該溶液標準物質溯源至國家一級標準物質GBW 10174，符合相關國家標準物質技術規范要求，特性值表示為（4.99±0.13）μg/mL。該標準物質的研制，為實現量值可比性提供了物質保障與技術支撐。