UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS法分析 補腎降濁顆粒的化學成分

顧雪晶,孫 正,郝 騰,李艷麗, 2,朱圓瑛,吳 燕,康立圓,許 卉

(1.煙臺大學藥學院,山東 煙臺 264005;2.濱州市中醫醫院,山東 濱州 256601)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最嚴重的慢性并發癥之一,大約30%～40%的糖尿病患者會出現腎臟疾病,臨床上以持續性白蛋白尿、腎小球濾過率進行性下降為主要特征,同時增加了患者患高血壓和心血管疾病的風險[1]。中醫認為DN多因氣陰兩虛、腎氣不固導致淤阻經脈,治療需以補腎固精、益氣活血為治療原則[2-3],而補腎降濁顆粒具有補腎降濁、活血通絡的功效。補腎降濁顆粒是在經典名方六味地黃丸基礎上結合臨床經驗加味而成的院內中藥制劑[4],經過臨床反復實踐,治療DN療效確切,有利于延緩DN發病進程。

中藥復方制劑成分十分復雜,發揮藥效不是單一成分的簡單加和,而是多成分協同起效[5-6],因此,同時檢測盡可能多的化學成分至關重要。目前,補腎降濁顆粒的化學成分研究未見報道,而超高效液相色譜四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用技術(UPLC-Q-Orbitrap-HRMS)具有高選擇性、高靈敏度、高準確度等優勢,被廣泛應用于中藥復方物質基礎研究[7-8]。本研究首次利用質譜聯用技術對補腎降濁顆粒的化學成分進行快速分離鑒定,為進一步研究藥效物質基礎及質量控制提供參考。

1 材 料

Thermo Scientific 高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO),TGL-20W型臺式高速冷凍離心機(上海湘儀實驗室儀器開發有限公司),SK250HP型超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司),補腎降濁顆粒(批號20220212,濱州市中醫院),甲醇、乙腈均為色譜純(美國默克公司),娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方 法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～4 min 2% B,10～18 min 10%～25% B,35～47 min 45%～60% B,47～55 min 60%～90% B,55～60 min 90% B,60.1～64 min 2% B),流速:0.3 mL/min,柱溫:40 ℃,進樣量:2 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),在正、負離子模式下分別進行檢測,掃描范圍:m/z80～1200,鞘氣流速:50 L/min,輔助氣流速:10 L/min,噴霧電壓:3500 V,輔助器溫度:350 ℃,離子化電壓:5500 V,碰撞能量:20、40、60 eV。

2.2 溶液制備

取補腎降濁顆粒適量,研細,取約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇溶液40 mL,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,再次稱重,用甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,過0.22 μm濾膜,即得。

2.3 數據分析

采用Thermo Xcalibur 4.0軟件進行數據采集,根據高分辨質譜提供的準分子離子和加合離子等信息推測并得到精確相對分子質量,再由Xcalibar 4.0軟件擬合計算分子式,與Compound discovery 3.2軟件和本地自建數據庫相匹配,依據化合物數據庫及國內外文獻報道的信息,確認化學成分及結構。

3 結 果

采用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS方法對補腎降濁顆粒的化學物質組成進行快速分析,按“2.1”項下的色譜和質譜條件,分別進行正、負離子模式掃描,采集得到正、負離子模式下的色譜圖,結果如圖1所示。針對質譜中得到的準分子離子和特征碎片離子信息,結合文獻進行分析,推測了173個化合物,其中主要包括黃酮類、有機酸類、酚類、萜類等,結果匯總見表1。分別選取各結構類型的代表性成分,根據一級和二級質譜數據,對化合物進行鑒定,分析化合物裂解方式。

表1 補腎降濁顆粒中的化學成分

3.1 黃酮類化合物裂解途徑分析

圖2 芒柄花苷二級質譜圖和裂解途徑

3.2 有機酸類化合物裂解途徑分析

共鑒別出有機酸類化合物36個,以化合物金雞納酸為例,在正離子模式下經一級質譜掃描得準分子離子峰m/z192.057 9 [M+H]+,預測其分子式為C7H12O9,二級質譜圖顯示m/z173.008 4、145.049 7、129.0544、111.007 4、85.028 0。通過計算可以歸屬得到的碎片離子,準分子離子失去一個COOH,得到碎片離子m/z145.049 7 [M+H-COOH]+;隨后失去一個OH得到碎片離子m/z129.054 4 [M+H-COOH-OH]+;再失去一個OH,得到基峰碎片離子m/z111.007 4 [M+H-COOH-OH-OH]+;準分子離子失去一個H2O,得到碎片離子峰m/z173.008 4 [M+H-H2O]+;隨后再失去一個COOH,一個OH,一個C—O,得到碎片離子峰m/z85.028 0 [M+H-COOH-CHO2]+。根據以上碎片離子信息,推測該化合物為金雞納酸,其二級質譜圖及可能的質譜裂解途徑見圖3。

圖3 金雞納酸二級質譜圖和裂解途徑

3.3 萜類化合物裂解途徑分析

共鑒別出萜類化合物45個,以化合物丹參酮ⅡA為例,在正離子模式下經一級質譜掃描得準分子離子峰m/z295.132 2 [M+H]+,預測其分子式為為C19H18O3,二級質譜圖顯示m/z280.168 9、262.098 1、249.126 4、184.075 3、81.070 3。通過計算可以歸屬得到的碎片離子,準分子離子失去一個CH3,得到碎片離子m/z280.168 9 [M+H-CH3]+;隨后失去C5H2O4,得到基峰碎片離子m/z184.075 3 [M+H-C5H2O4]+;再失去一個C8H7,得到碎片離子m/z81.070 3 [M+H-C5H2O4-C8H7]+;準分子離子失去一個H2O和一個CH3,得到碎片離子m/z262.098 1 [M+H-H2O-CH3]+;再失去一個H2O和一個C—O,得到碎片m/z249.126 4 [M+H-H2O-CO]+。根據以上碎片離子信息,推測該化合物為丹參酮IIA,其二級質譜圖及可能的質譜裂解途徑見圖4。

圖4 丹參酮ⅡA二級質譜圖和裂解途徑

3.4 酚類化合物裂解途徑分析

共鑒別出酚類化合物18個,以化合物白皮杉醇為例,在負離子模式下經一級質譜掃描得準分子離子峰m/z243.065 9 [M-H]-,預測其分子式為C14H12O4,二級質譜圖顯示m/z226.055 7、135.048 3、121.028 1、109.028 1。通過計算可以歸屬得到的碎片離子,失去一分子的H2O,得到碎片離子m/z226.055 7 [M-H-H2O]-;失去C6H2O, 得到碎片離子m/z135.043 8 [M-H-H2O-C6H2O]-;再失去一個CH2,得到碎片離子m/z121.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-;再失去一個CH3,得到碎片離子m/z107.028 1 [M-H-H2O-C7H4O]-。根據以上碎片離子信息,推測該化合物為白皮杉醇,其二級質譜圖及可能的質譜裂解途徑見圖5。

圖5 白皮杉醇二級質譜圖和裂解途徑

3.5 糖和苷類化合物裂解途徑分析

共鑒別出糖和苷類化合物21個,以化合物乙基-β-D-吡喃葡萄糖為例,在負離子模式下經一級質譜掃描得準分子離子峰m/z221.066 2 [M-H]-,預測其分子式為C8H14O7,二級質譜圖顯示m/z161.044 5、113.024 4、75.028 7。通過計算可以歸屬得到的碎片離子,準分子離子失去一個COOH和一個OH,得到碎片離子m/z161.044 5 [M-H-COOH-OH]-;失去C2H9O,得到碎片離子m/z113.024 4 [M-H-COOH-OH-C2H9O]-;失去C3H2,得到碎片離子m/z75.008 7[M-H-COOH-OH-C2H9O-C3H2]-。根據以上碎片離子信息,推測該化合物為乙基-β-D-吡喃葡萄糖,其二級質譜圖及可能的質譜裂解途徑見圖6。

圖6 乙基-β-D-吡喃葡萄糖二級質譜圖和裂解途徑

4 討 論

目前已有多項關于補腎降濁藥方中單味藥材的研究,尚未有關于該復方顆粒中化學成分的報道。本研究采用的UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術,用于分析中藥復方的復雜成分具有很大的優勢,該技術結合了Q Exactive的高靈敏性和Orbitrap的高準確性[9-11],可以增加補腎降濁顆粒中化學成分的檢出。對比正、負離子兩種掃描模式,正離子模式下的質譜響應較強,但是不同化合物在不同掃描模式下響應不同[12-13],為獲得全面的化合物信息,采用兩種離子掃描模式以獲得更全面的化合物信息?？傠x子流圖可知出峰時間大多集中在35～55 min范圍內。在建立色譜條件的過程中,選擇梯度洗脫的目的是讓樣品中強保留組分也能被洗脫出來,該方法是組分復雜的樣品常采用的洗脫方式[14]。為確定最佳的色譜條件,將10～18 min,45～60 min范圍內的梯度變化加快,增加樣品出峰數量,若使用比較緩慢的梯度會導致出峰較少、分離度差,而20～40 min范圍內需要減慢梯度,以保證色譜峰的分離度,最終確定了最優的梯度洗脫條件。同時,在流動相中加入0.1%甲酸溶液可有效改善峰型和離子化效果。

5 結 論

本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術,確定了最優的色譜和質譜條件,建立的檢測方法用于補腎降濁顆粒的化學成分分析,高效、準確?？偣茶b定出173個化學成分,正離子模式下鑒別出91個化合物,負離子模式下鑒別出82個化合物。首次明確了萜類、黃酮類、有機酸類化合物是補腎降濁顆粒的主要組成成分,從整體上明確了補腎降濁顆粒的化學成分,為進一步研究藥效物質基礎和質量控制提供了理論依據。