藜麥RBOH基因家族的鑒定及表達模式分析

韓建瑋,楊冬冬,曹 萌,張 俠,郭善利,2,尹海波

(1.煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005;2.青島農業大學草業學院,山東 青島 266109)

植物為了適應環境變化,進化出多種保護機制以抵抗各種生物和非生物逆境脅迫,其中一種是產生活性氧(ROS),如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)等。ROS在生物體內具有雙重作用,一方面逆境下過度產生的活性氧對細胞具有毒害作用,另一方面,ROS可作為信號分子參與植物的生長發育和脅迫響應。NADPH氧化酶(NOXs)是產生ROS的關鍵酶,NADPH氧化酶gp91phox在哺乳動物吞噬細胞中被首次鑒定[1],與植物、真菌中發現的各種gp91phox同源物組成NOX家族,在植物中又被稱為呼吸爆發氧化酶同源物(respiratory burst oxidase homologue,RBOH)[2]。RBOH蛋白活性與其結構密切相關,以往研究發現RBOH具有相同的功能結構,包括NADPH-Ox結構域(NADPH-Ox domain),類似于鐵還原酶的跨膜成分(Ferric-reduct),FAD結合結構域(FAD-binding domain),NAD結合結構域(NAD-binding domain)和兩個EF-hand保守基序。

植物中第一個被鑒定出來的gp91phox同源物為水稻OsRbohA[3],隨后陸續在其他植物物種中鑒定出了更多的RBOH基因,如擬南芥[4]、水稻[5]、大麥[6]、蘋果[7]和葡萄[8]中分別存在10個、9個、6個、9個和7個基因家族成員。據報道,植物呼吸爆發氧化酶同源物在植物發育、防御反應和激素信號轉導中起著重要作用。以深入研究的模式生物擬南芥為例,鑒定出了10個AtRbohs(AtRbohA—AtRbohJ),AtRbohD和AtRbohF不僅在植物防御反應[9]和鹽脅迫下Na+/K+穩態調節發揮重要作用[10],而且還參與重金屬離子脅迫下的氣體交換和離子穩態調節。通過使用CdCl2處理野生型和Atrbohs突變體擬南芥,發現AtRbohs基因功能喪失導致根系伸長區Cd2+流入升高,影響其氣孔傳導、蒸騰和抗氧化反應,在AtRbohD和AtRbohF突變體中最為明顯[11]。除此之外,AtRbohD和AtRbohF還在擬南芥ROS依賴性ABA信號傳導中起重要作用[12]。其他AtRbohs同樣在擬南芥生長發育過程中扮演重要角色,如:AtRbohB是擬南芥種子發芽過程中ROS的主要生產者,在種子成熟后發揮重要作用[13];AtRbohC參與根毛或花粉管的尖端生長[14]。目前已對擬南芥RBOH基因的相關研究較為深入,而對其他植物RBOH基因的研究剛剛起步。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)屬于莧科藜屬,原產于安第斯山脈的一年生作物,是世界上最古老的栽培作物之一。藜麥種子富含氨基酸、脂質、維生素和礦物質等營養元素[15],而且具有耐鹽堿、耐干旱等優良的抗逆性,近年來成為植物抗逆領域的研究熱點材料之一。藜麥在抗逆和糧食安全方面展現出了巨大潛力,但未發現有CqRBOH基因功能研究的相關報道。本研究對藜麥9個CqRBOH基因的特征和功能進行分析,為進一步深入研究CqRBOH在非生物脅迫下的響應模式和信號通路作用機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 CqRBOH基因家族鑒定及理化性質分析

從藜麥基因組數據庫(http://www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb/)中下載基因組文件。從Pfam(http://pfam.janelia.org/)網站中下載RBOH蛋白特征性的保守域[16],包括NADPH-Ox(PF08414)、Ferric-reduct(PF01794)、FAD-binding-8(PF08022)和NAD-binding-6(PF08030)的HMM模型,通過HMMER3.0軟件在藜麥全基因組蛋白序列中搜索(E-value=1×e-10)候選蛋白。利用NCBI的Batch CD-Search工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對候選RBOH蛋白保守結構域進行鑒定,去掉錯誤和重復成員。利用ExPASy(https://web.expasy.org)預測CqRBOH蛋白理化性質,通過Protcomp(http://linux1.softberry.com/berry)進行亞細胞定位預測。

1.2 CqRBOH蛋白系統進化分析

分別從擬南芥(https://www.arabidopsis.org/)、水稻(http://rice.uga.edu/)、玉米(https://maizegdb.org/)數據庫下載RBOH基因編碼的蛋白質序列,使用MEGA7中的ClustalW程序比對藜麥等4個物種的RBOH蛋白序列,比對結果通過鄰近法(neighbor-joining,NJ)構建進化樹,bootstrap值設為1000。

1.3 CqRBOH基因結構及其編碼蛋白的保守基序、序列比對分析

利用基因結構顯示工具GSDS2.0(http://gsds.cbi.pu.edu.cn/)對CqRBOH基因進行作圖分析,確定其外顯子-內含子結構;將鑒定出的CqRBOH蛋白序列導入MEME在線網站(http://meme-suite.org/tools/meme)進行保守基序(Motif)搜索,Motif個數設置為8個;采用DNAMAN v.8.0軟件進行CqRBOH氨基酸多重序列比對。

1.4 CqRBOH基因順式作用元件分析

通過藜麥參考基因組的基因組序列文件和基因注釋信息文件,提取轉錄起始位點上游2000 bp的啟動子序列,輸入到PLANTCARE[17](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測CqRBOH基因啟動子的順式作用元件分布和種類。

1.5 CqRBOH基因染色體定位及共線性分析

藜麥CDS和GFF和基因組序列數據來自ChenopodiumDB,利用共線性掃描工具包MCScanX[18]進行運行分析,使用TBtools工具繪制circos圖[19]。

1.6 CqRBOH基因表達模式分析

藜麥RNA-Seq數據來源于NCBI中Sequence Read Archive(SRA)藜麥轉錄組測序結果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra),包括多種組織(登錄號:SRP226463、SRP116149)和干旱、高溫和鹽脅迫下的根和芽(登錄號:SRS1538629)。將TPM(每百萬讀取轉錄本)形式的RNA-seq數據進行歸一化并進行log2轉換,使用TBtools生成熱圖。

2 結果與分析

2.1 CqRBOH基因家族鑒定及理化性質分析

通過生物信息學方法從藜麥全基因組中鑒定篩選出9個CqRBOH基因(表1)。所編碼蛋白的氨基酸數量在815(CqRBOH7)～955(CqRBOH8)aa之間;分子質量為93.58(CqRBOH7)～108.39(CqRBOH8)kU;等電點在8.98(CqRBOH7)～9.37(CqRBOH5)均大于7,判定為堿性蛋白;不穩定系數分析發現,只有CqRBOH7為穩定蛋白(系數小于40);平均親水系數結果表明CqRBOH均為親水蛋白(系數小于0)。通過Protcomp預測蛋白亞細胞定位,發現CqRBOH均定位于質膜上。

表1 CqRBOH基因及編碼蛋白的基本特征

2.2 CqRBOH蛋白系統進化分析

為了研究CqRBOH蛋白與其他植物RBOH蛋白的進化關系,利用MEGA7.0對藜麥、擬南芥、水稻和玉米共43個RBOH蛋白序列構建NJ系統發育進化樹(圖1)。系統發育進化樹將9個CqRBOHs、10個AtRBOHs、9個OsRBOHs、15個ZmRBOHs聚類為6個亞組(Class Ⅰ、Class Ⅱ、Class Ⅲ、Class Ⅳ、Class Ⅴ和Class Ⅵ),Class Ⅰ包含2個CqRBOH成員(CqRBOH3、CqRBOH5);Class Ⅳ包含3個CqRBOH成員(CqRBOH6、CqRBOH7、CqRBOH8);Class Ⅴ包含2個CqRBOH成員(CqRBOH4、CqRBOH9);Class Ⅵ包含2個CqRBOH成員(CqRBOH1、CqRBOH2);Class Ⅱ、Class Ⅲ不包含CqRBOH成員,推測可能是藜麥進化過程中譜系特異性基因缺失引起的。除CqRBOH7,其他CqRBOH成員在同一分支中成對存在,且擁有很高的bootstrap值,組成4組旁系同源蛋白,這主要是由于異源四倍體藜麥在進化過程中發生了全基因組復制而導致的。

圖1 藜麥和其他植物RBOH蛋白系統發育進化樹

2.3 CqRBOH基因結構及其編碼蛋白的保守基序、序列比對分析

根據內含子-外顯子結構模式,將CqRBOH基因家族分為4個亞家族(紅、藍、黃、綠)(圖2(a))。除CqRBOH7,進化樹每一分支的RBOH基因成對存在,每一分支基因結構相似且內含子與外顯子數量一致,表明同一分支中兩個RBOH基因同源性很高。CqRBOH基因長度在4443 kb(CqRBOH9)～1 3841 kb(CqRBOH6)之間(圖2(b)),不同的CqRBOH基因家族成員結構存在一定差異,除一個分支(CqRBOH3和CqRBOH5)RBOH基因外顯子數量為10個,其他CqRBOH基因外顯子數量均為14個。在一些CqRBOH基因中,外顯子數量的增加似乎是內含子插入外顯子區域的結果,而不是獲取額外的外顯子。CqRBOH蛋白保守基序(圖2(c))分析表明,每個CqRBOH蛋白都包含8個Motif且種類數量一致,證明CqRBOH蛋白在進化過程中較保守。利用(圖2(d))進一步分析保守基序序列,在確定的8個Motif中,Motif 1為FAD-binding結構域的一部分;Motif 3、5和8為NAD-binding結構域的一部分,該結構域與超氧化物的生成有關;Motif 2、4和7是類似于鐵還原酶Ferric-reduct的一部分;Motif 6包含兩個EF-hands基序,與Ca2+依賴的磷酸化有關,逆境脅迫下Ca2+作為第二信使,通過與EF-hand結合使RBOH激活,進而產生ROS,作為信號分子調控植物生長發育和脅迫應答反應。

圖2 CqRBOH基因結構及其編碼蛋白的保守基序分析

對9個CqRBOH蛋白進行多重序列分析(圖3),結果分析表明這些序列高度保守,包括N端區域的兩個Ca2+結合EF-hands、6個跨膜結構域(TM1-6),以及C端區域的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、NAD-腺嘌呤(NADPH-adenine)和NADP-核糖(NADPH-ribose)保守結合位點。6個跨膜結構域(TM1-6)與擬南芥、水稻、玉米、大麥、馬鈴薯和煙草等植物Rbohs以及哺乳動物gp91phox中識別的結構域相對應,兩個跨膜結構域(TM3和TM5)分別包含兩對組氨酸殘基(紅色圓球標出)。研究發現,這些由兩對間隔組氨酸殘基組成的類似基序對人gp91phox蛋白中的血紅素配位結合非常重要[20]。

2.4 CqRBOH基因順式作用元件分析

順式作用元件存在于基因啟動子區域,可與轉錄因子結合調控下游基因的特殊基序。本研究分析了9個CqRBOH基因起始密碼子上游2000 bp基因序列,鑒定出了多種順式作用元件,詳細信息見表2。結果顯示,CqRBOH基因的光響應元件多達20多種,如GT1-motif、chs-CMA2a、AE-box、Box4等。除此之外,鑒定了9種激素響應元件,包括TATC-box、P-box、GARE-motif、ABRE、TGA-element、AuxRR-core、TCA-element、CGTAC-motif、TGACG-motif,分別反映了藜麥對赤霉素、脫落酸、生長素、水楊酸和茉莉酸甲酯的響應;還有一些關于非生物脅迫的響應元件,如MBS、LTR、TC-richrepeats、ARE和WUN-motif,它們與干旱、低溫、防御和應激、無氧誘導和創傷應激有關。某些順式作用元件還具有明顯的特異性,如CAT-box、GCN4-motif分別參與藜麥分生組織和胚乳表達?？傊?CqRBOH基因可能參與藜麥生長代謝和激素、脅迫應答,不同的CqRBOH啟動子中存在不同種類和數量的順勢作用元件,表明在不同非生物脅迫和不同植物激素下存在不同的調控機制。

表2 CqRBOH基因啟動子區順式作用元件的種類和數量分布

2.5 CqRBOH基因染色體定位及共線性分析

通過共線性分析確定了CqRBOH基因在染色體上基因組位置和潛在的基因組復制事件。結果表明,9個CqRBOH基因分布在8條染色體上,其中Chr16包含兩個CqRBOH基因(圖4)。多倍體化、串聯復制和片段復制是促進基因組進化和基因家族擴張的主要方式[21]。經共線性分析,3個基因共線性對(CqRBOH1/CqRBOH2、CqRBOH3/CqRBOH5、CqRBOH6/CqRBOH8)參與了片段重復,沒有發現串聯重復事件。此外,我們計算了這3對共線性基因的Ka和Ks之間的比例,進行選擇壓力分析(表3)。結果顯示,Ka/Ks的值均小于1,表明CqRBOH基因受到純化選擇作用。

注:Chr00為未組裝到藜麥亞基因組染色體的scaffolds

表3 CqRBOH基因的Ka/Ks

2.6 CqRBOH基因表達模式分析

為初步了解CqRBOH基因的功能,探究CqRBOH基因在藜麥生長發育中的作用,基于RNA-Seq數據分析了9個CqRBOH基因在不同組織器官表達情況(圖5)。發現同一分支中的CqRBOH基因表達模式相似。兩對CqRBOH基因(CqRBOH3/CqRBOH5、CqRBOH6/CqRBOH8)表達量達到可檢測水平,CqRBOH3和CqRBOH5在不同器官組織中均有表達,尤其在藜麥幼苗中表達量極高,推測CqRBOH3和CqRBOH5是調控藜麥生長發育的關鍵基因。CqRBOH6和CqRBOH8在葉柄中中幾乎不表達,但是在其它組織中表達量較高;CqRBOH4和CqRBOH9在所有組織器官中幾乎不表達;CqRBOH5在頂端分生組織和葉柄中表達量較低,但是在其它組織中表達量很高,表明CqRBOH基因具有組織表達特異性。CqRBOH基因對干旱、高溫和鹽脅迫響應模式分析結果如圖5所示,在地上部分(圖6(a))中,CqRBOH5和CqRBOH7在干旱、高溫和鹽處理下表達水平均下降,CqRBOH3僅在干旱處理下表達水平下降。在地下部分中(圖6(b)),CqRBOH3和CqRBOH5基因表達水平很高,但是對干旱、高溫的響應不明顯,CqRBOH4在高溫處理下表達水平上升。CqRBOH6、CqRBOH7和CqRBOH8在干旱高溫處理下表達水平均上調,但在鹽脅迫下無明顯變化。

圖5 CqRBOH基因在不同組織中的表達模式分析

圖6 非生物脅迫下CqRBOH基因在不同組織中的表達

3 討 論

本研究從藜麥基因組中鑒定出9個CqRBOH基因,分布在Chr01、Chr02、Chr05、Chr07、Chr12、Chr13、Chr16和Chr18這8條染色體上,3對基因對參與片段重復,表明片段復制在CqRBOH基因家族擴張中起到重要作用。Ka/Ks被認為是決定選擇壓力類型[22]的指標,藜麥共線性基因對間Ka/Ks均小于1且比例不同,說明這些基因在復制后經歷了不同程度的純化選擇。亞細胞定位預測結果顯示,藜麥與擬南芥和水稻相同,所有RBOH基因都定位在質膜上。在擬南芥、水稻、大麥中,除了AtRbohD包含8個外顯子和OsRbohD包含15個外顯子,大多數植物RBOH基因外顯子數量在10～14之間,這與藜麥內含子-外顯子結構模式一致。不同植物RBOH蛋白的系統發育樹顯示,CqRBOH與AtRBOH親緣關系更密切,這與它們同是雙子葉植物的事實一致。此外,聚集在同一組中的同源物可能涉及相似的功能,這需要進一步的實驗分析來證實這一點。氨基酸多重序列比對分析發現均存在2個EF-hands,6個TMs和FAD、NADPH結合位點,這些結構同樣也存在于其他植物物種中。有關研究發現[23],哺乳動物吞噬細胞gp91phox缺少EF-hand結構,因此植物NADPH氧化酶的調控途徑與哺乳動物吞噬細胞不同,植物RBOH蛋白的調節主要通過翻譯后修飾來進行調控,如Ca2+與EF-hand基序結合并磷酸化依賴性蛋白激酶[24]、絲裂原活化蛋白激酶[25]。從順式作用元件預測結果來看,9個CqRBOH基因的啟動子均含有大量光響應元件。除CqRBOH5外,其他CqRBOH啟動子均含有生長素響應元件。CqRBOH1啟動子含有10個脫落酸響應元件(ABRE),表明CqRBOH1可能在藜麥脫落酸信號傳導中起著重要作用。

對9個CqRBOH基因組織表達特異性和非生物脅迫下表達模式進行分析。CqRBOH基因表現出組織表達特異性,CqRBOH3和CqRBOH5在幼苗中有極高表達,但在葉柄中表達不顯著。據報道,玉米、水稻等其他物種中RBOH基因也存在組織表達特異性。如OsRbohD在愈傷組織中高表達,但是在穗中的表達十分微弱[26];ZmRbohF在初生根顯示出高表達,而在頂端葉表達量非常低[27]。值得注意的是,CqRBOH3和CqRBOH5在藜麥未成熟種子中有高表達,并且它們與AtRbohB(本文將該基因命名為AtRBOH1)具有高度同源關系(圖1),有人認為AtRbohB產生的ROS在蛋白質氧化和通過細胞壁松動而引起的種皮和胚乳機械破裂中起到重要作用,因此推測CqRBOH3、CqRBOH5與AtRbohB的功能相似,它們與藜麥種子萌發密切相關[28],這一結果與麻風樹JcRbohB在種子中高度表達一致[29]。除此之外,CqRBOH3在白甜藜花中顯著表達,而在苦黃藜花中表達不顯著,表明CqRBOH在同一物種不同品種的表達模式存在一定多樣性。在高溫脅迫下,CqRBOH4和CqRBOH6在地下部分表達水平顯著上調,CqRBOH2和CqRBOH7在干旱處理下顯著上調,說明它們可能參與藜麥地下部分對高溫、干旱脅迫的響應。RBOH基因除了響應高溫、干旱脅迫外,還參與低溫脅迫下的調控[8]。在低溫脅迫下,草莓FvRbohA和FvRbohD對冷脅迫反應迅速,轉錄水平提高;草莓幼苗NADPH氧化酶活性在早期急劇上升,隨后略有下降,但與0 h相比仍保持較高水平。

本實驗綜合分析了CqRBOH基因的理化性質、基因結構和蛋白基序、系統發育關系、轉錄表達模式等,為CqRBOH基因功能研究奠定理論基礎,對藜麥分子育種和遺傳改良具有指導意義。