小麥鏈格孢病原菌鑒定及產毒分析

張瑤瑤,盧蘇南,李彥伸,尤艷莉

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

鏈格孢霉菌是自然界常見的植物病原菌,能夠侵染谷物、蔬菜和水果,造成重大經濟損失[1-2]。鏈格孢霉菌是主要的產毒素真菌屬之一,已報道的鏈格孢霉菌產生的次級代謝產物超過70種[3],被稱為鏈格孢毒素。根據化學結構及毒性不同,常見的鏈格孢毒素主要分為四大類[4]:最大的一類是二苯吡喃酮化合物,代表性毒素有交鏈孢酚(alternariol, AOH)、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)、交鏈孢烯(altenuene, ALT);第二類是戊醌類化合物,代表毒素有ATX-Ⅰ (altertoxin-Ⅰ)、ATX-Ⅱ (altertoxin-Ⅱ)、ATX-Ⅲ(altertoxin-Ⅲ)等;第三類是四氨基酸衍生物如細交鏈格孢酮酸(tenuazonic acid, TeA)等;此外還有雜混結構如騰毒素(tentoxin,TEN)、酚類如細格菌素(altenusin, ALU)、環狀肽等[5-6]。鏈格孢毒素對人和牲畜具有急性毒性、細胞毒性、免疫毒性、胚胎毒性甚至是致畸、致癌和致突變性等危害[6-9]。另外,TEN具有植物毒性,導致植物萎黃病[10],被研究為除草劑。

2016—2022年對各類食品中的交鏈孢毒素進行監測,發現在小麥及其制品中AOH、AME、TEN和TeA污染最為嚴重,檢出率均超過90%[11-13]。國內外文獻中陸續報道了應用液相色譜-串聯質譜法檢測谷物等農產品中多種霉菌毒素的方法[14-15]。霉菌毒素因受到植物、動物和真菌代謝的影響,其結構在新陳代謝或食物加工過程中會發生改變,與極性物質如氨基酸、硫酸鹽或糖苷等結合發生修飾形成隱蔽型毒素[16]。這些修飾過的毒素攝入后會在消化道釋放游離毒素,給健康帶來潛在的危險[17];而這些結構修飾的霉菌毒素在常規提取條件下能夠保持穩定,無法通過常規分析技術檢測到。由于缺乏可靠的商業化標準品和相關研究數據,難以對這些真菌毒素進行有效全面的檢測。因此,監測這些潛在有害代謝物的存在是確保食品安全的主要任務之一。

液相色譜質譜聯用技術是近年來真菌毒素分析領域發展最快的分析方法之一,具有特異性強、靈敏度高等優點[18],但是液相色譜-串聯質譜法在定性定量準確度方面仍存在不足,而且限制于靶向分析,無法對復雜基質中多種未知風險物質進行篩查[19]。近年來,高分辨質譜的發展解決了這一問題。高分辨質譜相對于一般串聯譜,分辨率和分子質量精度均更高[20]。Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜基于目標化合物母離子精準質荷比直接對目標化合物定性定量,具有很強的抗基質干擾能力,適用于未知化合物快速篩查[21]。

本研究從東營市小麥種植區病變小麥中分離純化并鑒定出12株鏈格孢霉菌,基于前期研究[22]開發的超高效液相色譜串聯高分辨質譜(UPLC-HRMS)結合數據分析軟件技術,對鏈格孢霉毒素和隱蔽性毒素進行可視化分析;并且模擬室溫下鏈格孢侵染小麥種子,對小麥萌發過程產生的鏈格孢毒素進行定性和定量分析。本研究可為谷類小麥鏈格孢毒素的發生規律提供理論依據,為我國的食品安全風險評估提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥種子購自山東省煙臺市,要求顆粒飽滿,無機械損傷和病害;馬鈴薯購自山東省煙臺市煙大市場。于小麥抽穗期收集山東省東營市小麥種植區病變小麥樣品。

交鏈孢毒素標準品:ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN購于青島普瑞邦(Pribolab)生物工程有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 購自北京陸橋科技有限公司;植物基因組DNA試劑盒(DP305)購自TIANGEN;蔗糖(分析純)購自西隴化工股份有限公司;瓊脂購自上海吉至生化科技有限公司;氯化鈉(分析純)、乙腈(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、甲醇(色譜純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)由實驗室制備:量取500 mL馬鈴薯提取液,稱取20 g蔗糖,17 g瓊脂,于500 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌20 min,倒入9 cm 一次性培養皿中,待培養基冷卻凝固后裝袋密封,室溫保存備用。馬鈴薯提取液:把400 g去皮馬鈴薯切成小塊,用紗布包好,在1 L水中煮沸10 min,過濾到錐形瓶內,121 ℃高壓滅菌20 min,將馬鈴薯提取液保存在冰箱中備用。

1.2 儀器與設備

SHH-250L生化培養箱(重慶市永生實驗儀器廠);3k15高速臺式冷凍離心機(德國SIGMA公司);QL-901型渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);血球計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司);電子顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司);JA-1003N分析天平(上海精密科學儀器有限公司);超高效液相色譜系統(UltimataTM 1290)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);四級桿/靜電場軌道離子阱高分辨質譜儀(Q-Exactive Plus)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 病原菌分離與純化 采用組織培養法,對小麥中的病原菌進行分離純化。小麥籽粒用無菌水沖洗,去除表面雜質。用75%的乙醇清洗處理30 s,后經5%次氯酸鈉清洗消毒2～3 min,無菌水清洗3次,無菌濾紙片擦干水分,將適量籽粒接種于含氯霉素的PDA培養基。25 ℃恒溫培養箱中培養3～4 d,培養期間注意觀察菌落生長情況。根據菌絲的生成位置、顏色,挑取不同性狀的單個菌落孢子接種于新的PDA培養基中,直至得到純種菌株。將純化后的菌株保存在25%的甘油中,放置在-80 ℃保種。

1.3.2 病原菌鑒定 對分離純化得到的病原菌,在PDA培養基培養10 d左右,使用植物基因組DNA試劑盒提取菌株DNA,進行PCR擴增,采用真菌ITS通用引物基因進行序列擴增,上游引物ITS1和下游引物IITS4序列分別為:ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS4 (5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇),目標片段600 bp。將擴增產物送至煙臺碩博源生物科技有限公司測定堿基序列,將獲得的序列在NCBI網站提交至GenBank數據庫,采用BLAST程序[23]對比獲得同源序列,最后借助MEGA X[24]軟件建立系統進化樹。

1.3.3 標準溶液配置 用千分之一分析天平分別準確稱取1.00 mg ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN鏈格孢毒素標準品至2 mL 棕色小瓶,分別加入1 mL 乙腈,配制1 mg/mL 鏈格孢毒素標準儲備液用甲醇將標準儲備液稀釋配制成100 μg/mL 鏈格孢毒素單標溶液,存于-20 ℃。

1.3.4 鏈格孢霉產毒分析 將12株鏈格孢霉菌編號如下:BM2-1,BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,GM2-1-1,MG2-1,MG2-2,MT3-3,XM1,XM2,XM3,XM5。將復蘇后的菌株分別接種至PDA 和PSA 培養基,于25 ℃進行培養和產毒研究,對培養10 d左右的菌株進行毒素提取。用無菌1 mL槍頭取出6個瓊脂塊,放入10 mL EP管內。加入4 mL乙酸乙酯,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液轉移到新的10 mL EP管中,在40 ℃進行氮吹,吹干后加入750 μL甲醇,渦旋1 min復溶, 再加入250 μL的超純水,將復溶物轉移至到2 mL的進樣瓶中。樣品經0.22 μm注射器過濾器過濾后進入自動進樣器小瓶,然后進行UPLC-HRMS分析[25]。

1.3.5 小麥萌發過程中鏈格孢毒素產生實驗 (1)鏈格孢霉接種小麥種。經預實驗發現鏈格孢霉菌株GM1-1-2和XM5均產鏈格孢毒素且種類不同,用無菌生理鹽水將兩株菌株制成孢子懸液。采用培養皿濾紙法培養小麥種子。選取大小一致,籽粒飽滿的小麥種子,用75%乙醇泡3～5 min,用超純水分別沖洗3次,最后用濾紙將水吸干。置于帶滅菌濾紙片的培養皿中,每個培養皿50粒小麥均勻地擺在培養皿中,加入適量去離子水,液面高度為小麥種子高度的1/3～1/2處,噴灑孢子懸液。

(2)鏈格孢霉毒素提取。取適量小麥樣品剪碎。稱取剪碎好的樣品2.00 g于10 mL離心管中,加入4 mL乙酸乙酯,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液轉移到新的10 mL EP管中,再加入4 mL乙腈,渦旋3 min,超聲30 min,再次渦旋3 min,固定在振蕩器中振蕩30 min。將上清液混合在一起,在40 ℃氮吹,吹干后加入750 μL甲醇,渦旋1 min復溶,再加入250 μL的超純水。將復溶物過0.22 μm有機濾膜,用UPLC-HRMS檢測[25]。

1.3.6 霉菌毒素的UPLC-HRMS檢測及條件設置 采用超高效液相色譜串聯高分辨質譜正離子模式進行定性分析。色譜條件:色譜柱Hypersil GOLDTMC18 (100 mm×2.1 mm i.d.,1.9 μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫如下:0～2 min 5% B、2～3 min 5%～30% B、3～4 min 30%～40% B、4～5.5 min 40%～55% B、5.5～7.5 min 55%～95% B、7.5～9.0 min 95～5% B、9.0～12.0 min 5% B;進樣體積為5 μL,流速為0.3 mL/min;柱溫為40 ℃。質譜條件:選擇數據依賴性采集掃描(DDA)模式;全掃描分辨率70 000 FWHM,掃描m/z范圍在120～900,自動增益(AGC Target)設置為3.0×106,最大離子注入時間(maximum IT)100 ms。本工作采用前5位MSMS掃描(ddMS2),分辨率17 500 FWHM。Loop count:10。AGC Target:8.0×103。Maximum IT:50 ms,Isolation window為1.5 Da,碰撞能量(N)CE:20、40、70。最低強度閾值:1.0×103。

1.3.7 數據分析 通過Thermo公司開發的Xcalibur軟件與商業標準品對比精準質荷比、元素組成和子離子等信息對霉菌天然產物進行定性分析。MZmine中的診斷片段過濾器是一種針對TMS和MS/MS的采集后數據過濾技術,有效地檢測出復雜提取物中給定類的所有化合物[26]。使用MZmine 2的診斷碎片過濾功能[27](Diagnostic Fragmentation Filtering,DFF)對二項結合產物進行篩選。前期對鏈格孢霉菌株在培養基產毒數據分析顯示,幾種代謝物解離的中性丟失分子質量為79.956 8 U,推測存在SO3結合的代謝產物。因此本研究中設置診斷中性損失值為79.956 8 U,質荷比公差為0.02或者5.0×10-6,基峰設置為20%。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態及分子生物學鑒定

采用組織分離法,從病變小麥中分離純化得到12株病原菌。如圖1(a)所示菌落生長較快,菌絲發達,菌落表面不平,呈絨氈狀。BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,XM2和XM3菌落中心呈墨綠色,中間下陷,有明顯的環狀輪紋,基質呈灰褐色,顏色較深;MG2-1和XM5菌落初期為灰白色,后轉為黑褐色,邊緣菌絲顏色比內圈顏色深,基質呈褐色;BM2-1,GM2-1-1,MG2-2和MT3-3,菌落為灰白色或灰褐色,中心凸起,邊緣整齊,有明顯的環狀輪紋;XM1菌落的菌絲初期為白色,后期菌落內圈色澤逐漸變暗轉為黑褐色或黃褐色,邊緣仍呈白色。

提取12株霉菌DNA進行PCR擴增后,凝膠電泳結果為12株菌條帶均在600 bp左右(圖1(b)),且條帶清晰,可進行下一步測序。將測序結果整理后在NCBI進行Blast對比,找到同源序列構建進化樹,進化樹結果表明,11株(BM2-1,BM3-2,GM1-1-1,GM1-1-2,GM2-1,MG2-2,MT3-3,XM1,XM2,XM3和XM5)為互隔交鏈孢菌(Alternariaalternata),1株(MG2-1)為蕓苔鏈格孢菌(Alternariabrasicae),表明小麥病變優勢病原菌為鏈格孢菌。

2.2 游離霉菌毒素確證

采用ESI+模式在固體培養基中檢測并鑒定了7種交鏈孢菌毒素。7種霉菌毒素的名稱、化學式、加合物、保留時間、質荷比等信息見表1。與市售標準品對比精準質荷比、保留時間和質譜等信息對鏈格孢霉菌的7種毒素(ALT、ALU、AME、AOH、ATX-Ⅰ、TeA和TEN)進行了鑒定和定量,標準品和樣品中鏈格孢毒素提取毒素色譜和質譜圖如圖2所示。

表1 鏈格孢毒素自定義數據庫

2.3 隱蔽型毒素篩選與鑒定

前期對鏈格孢霉菌菌株在固體培養基產毒原始數據的初步檢測顯示,幾種代謝物解離的中性丟失分子質量為79.956 8 U,推測存在SO3結合的代謝產物。為了充分研究代謝物中是否存在的硫酸鹽結合,使用MZmine 2軟件對完整原始數據集進行碎片過濾診斷,得到中性丟失結果,將失去的相應SO3(79.956 8 U)分子質量的前體離子進行可視化展示(圖3)。在固體培養基中找到了35種硫酸鹽結合的霉菌毒素,其中PDA培養基中15種、PSA培養基中20種,小麥中未發現硫酸鹽結合產物。

圖3 硫酸鹽結合產物的中性丟失

用Xcalibur軟件進一步確證了硫酸鹽結合化合物篩選結果,證實在固體培養基有兩種硫酸鹽結合的鏈格孢毒素,其出峰時間分別為6.45 min和9.10 min(圖4(a))。除了以硫酸鹽結合精確分子質量和SO3的準確中性丟失值為依據外,還通過同位素峰確定分子上存在硫原子。在質譜中,13C×2同位素峰原子質量比單一同位素峰高2.005 U,自然豐度為4.29%的34S的原子質量位移比單一同位素質量高1.995 U,證實硫酸化偶聯物結構中存在一個S原子[28](圖4(b))。通過二級碎片質譜圖對結合型毒素進行確認(圖4(c)、(d)),證實兩種硫酸鹽結合的鏈格孢毒素,分別為AOH硫酸鹽和AME硫酸鹽。兩種結合型毒素的出峰時間晚于其游離型毒素,與負模式下硫酸鹽結合的保留時間早于游離鏈格孢毒素不同。

圖4 硫酸鹽結合產物確證

2.4 鏈格孢毒素Heatmap分析

利用R語言軟件基于峰面積建立熱圖,對鏈格孢霉菌在培養基中產生毒素的含量和種類情況進行可視化分析。如圖5所示,鏈格孢霉菌在PDA和PSA培養基中產毒存在差異,所有的菌株均產AOH、AME、ATX-I毒素;只有XM5、XM3、MT3-3不產ALU;除了XM3,其他11株均為產ALT菌株;除了BM2-1、GM2-1、XM2、XM5,其他菌株均產TEN毒素;只有BM2-1、GM1-1-1、GM1-1-2、GM2-1 4株菌株產TeA毒素。而且硫酸鹽結合的鏈格孢毒素只在PSA培養基中產生,推測可能與培養基碳源種類不同有關,葡萄糖促進菌絲的生長,但是蔗糖更有利于孢子的產生[29],所以PSA中的蔗糖比PDA中的葡萄糖更有利于毒素的產生。

圖5 鏈格孢霉菌在PDA和PSA培養基上產生的鏈格孢毒素熱圖分析

2.5 小麥萌發過程中鏈格孢毒素產生情況分析

在固體培養基中,菌株GM1-1-2產毒素AOH、AME、ALU、ALT、TEN、TeA、ATX-Ⅰ,XM5產毒素AOH、AME、ALT和ATX-Ⅰ;但是在小麥萌發試驗中,GM1-1-2 和XM5試驗組只檢測到毒素AOH、TeA和TEN產生。由表2可知,總體來看,霉菌毒素隨著時間增加含量升高。GM1-1-2試驗組在第4天檢測到AOH的產出,隨著時間增加毒素含量上升,到第10天達到71 μg/kg;TEN和TeA在第6天開始檢出,TEN在第8天含量最高為130 μg/kg,TeA在第10天含量最高達11151 μg/kg。XM5試驗組在第2天檢出AOH和TEN,但是含量較低,AOH在第10天達到最高含量為89 μg/kg,TEN在第10天含量最高為62 μg/kg;而TeA只在第10天被檢出,含量高達1 128 μg/kg。

表2 鏈格孢霉菌侵染小麥中霉菌毒素定量結果

3 討論與結論

本研究對山東省東營市小麥種植區病變小麥中致病菌株進行分離純化,結合形態學特征和分子生物學對病原菌進行鑒定,發現小麥病變的優勢菌株為互隔交鏈孢霉,這與李毅然等[30]對進口小麥攜帶的病原微生物檢測結果和匡開源等[31]對陜西大骨節病區的小麥樣品檢測結果相同。12株鏈格孢霉菌在固體培養基中共檢測到7種游離鏈格孢毒素(AOH、ALT、ALU、AME、ATX-Ⅰ、TeA、TEN)和2種隱蔽型毒素(AOH-Sulfated和AME-Sulfated)。12株鏈格孢菌產毒能力和種類存在差別,這種差異可能與鏈格孢霉產毒基因有關[32-33]。將2株產毒種類不同的鏈格孢霉菌的孢子懸液接種于小麥種子后,在小麥萌發過程中只檢測到毒素AOH、TeA和TEN。鏈格孢霉菌在侵染植物時,病原菌與宿主植物相互調節作用可能會影響毒素的產生,由植物產生的信號分子或次生代謝產物對毒素的產生起促進或抑制作用[34],因此小麥中鏈格孢毒素的產生與人工培養基中存在差異。

研究結果表明,互隔鏈格孢菌(Alternariaalternata)是病害小麥的優勢病原菌,可產生鏈格孢毒素。鏈格孢霉菌在固體培養基中產生的毒素與在小麥萌發過程中產生的毒素不同。因此,研究谷類中鏈格孢毒素的發生規律,可為減少鏈格孢霉病害導致的谷物品質損失提供理論依據。